灌胃納米超氧化物歧化酶脂質體對小鼠潰瘍性結腸炎的改善作用

黎俏靈，李鶴年，郭靜科，朱則亮，滕 薇，胡雨嘉，羅圓圓，王夢田，劉樹滔,*

（1.福州大學生物工程研究所，福建 福州 350002；2.福州大學至誠學院，福建 福州 350002）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種特發性腸道炎癥，可導致便血便稀、腹痛、體質量下降，甚至胃腸道穿孔、排泄失禁等癥狀[1]，極大地危害了人們的身心健康；且UC近年來發病率持續上升，已成為全球性備受關注的問題[2]。目前UC病因的潛在機制尚未完全闡明，但有研究表明氧化應激是導致UC的一個重要的因素。活性氧（reactive oxygen species，ROS）指通過氧分子還原產生的初始物質及其次級反應產物，具有高度反應活性。當機體內ROS過量生成且無法被及時清除時便會破壞原有的氧化還原穩態，從而導致氧化應激，進而引起細胞膜脂質過氧化作用并造成機體的損傷，包括腸道通透性增加甚至腸道細胞溶解，導致UC發生[3-4]。過量的ROS會破壞腸上皮細胞蛋白，進而破壞胃腸道屏障，增加腸道通透性，導致炎癥的發生[5]。很多研究表明腸黏膜中ROS的過量產生可增強炎癥反應，導致黏膜損傷，加速炎癥反應，發生腸潰瘍[6]。因此，清除ROS已被用作緩解UC的有效策略[7-9]，如周曉玲等[9]的研究中發現南極磷蝦油可以通過提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的表達以及調節核因子紅細胞2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白（Kelchlike ECH-associated protein，Keap）1信號通路減少ROS含量，從而改善UC小鼠的氧化損傷。

SOD是一種內源性抗氧化物酶，能催化超陽陰離子自由基生成O2和H2O2。SOD具有抑制ROS作用，并由于其良好的抗炎、抗氧化等活性，在保健食品或者食品營養強化劑中具有廣泛的應用，因此SOD可作為食品功能因子預防或者緩解UC癥狀[10-12]。但SOD在胃腸道中的性質不穩定，口服后易因胃液極低的pH值和胃蛋白酶破壞損失酶活性[13-14]，因此，SOD在實際應用中常需要通過變性、重組、修飾和包埋等手段提高其生物利用度[15-16]。

納米遞送具有低毒副作用、高穩定性、緩釋和控釋活性物質及蛋白靶向釋放等優點，因此納米遞送系統在活性物質遞送和營養素遞送領域中受到廣泛關注和研究[17]。目前遞送系統主要包括納米乳、納米囊、脂質體納米顆粒和聚合物膠束等[18]，已被運用于各種天然活性成分、營養素以及微量元素的遞送。其中脂質體由可食用的生物材料組成，具有無毒、可緩釋活性物質和生物相容性高等優點[19]，因此被廣泛用于天然活性成分遞送系統，如Jubeh等[20]發現經脂質體包埋后的SOD能更好地降低UC大鼠結腸組織中乳酸脫氫酶含量進而預防腸道氧化應激損傷；周建森等[21]評估發現反式激活蛋白-SOD經過脂質體包埋后對于UC大鼠具有更好的改善作用，且脂質體包埋可以提高反式激活蛋白-SOD對胃酸及胃蛋白酶的耐受性，降低機體內氧化應激水平，進而修復結腸組織損傷并發揮其改善UC的作用。

基于口服給藥方便且使用依從性高，蔡麗萍等[22]通過加熱制備自組裝SOD納米顆粒物以提高SOD的活力、穩定性以及其生物利用度。本實驗將納米-SOD（nano-SOD，以下簡稱ΔSOD）包埋于脂質體中得到L-ΔSOD，探討L-ΔSOD改善UC模型小鼠的作用。SOD在水溶液中加熱易于自組裝成納米顆粒，而脂質體包封過程簡單且可重復，有利于維持蛋白質的生物活性并提高SOD在胃腸道中的穩定性，并有利于SOD靶向至炎癥部位[23-24]。所以本實驗分析脂質體包埋ΔSOD對UC模型小鼠的改善作用，以期為UC的輔助治療食品研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

ICR清潔型小鼠購于浙江省實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（浙）2019-0002。

SOD凍干粉 天津生命科學研究所；膽固醇、胃蛋白酶（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）Annexin V細胞凋亡檢查試劑盒I 生工生物（上海）股份有限公司；胰酶（分析純） 美國Amersco公司；大豆卵磷脂（分析純） 薩恩化學技術（上海）有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、細胞增殖試劑盒（cell-counting kit，CCK）-8、Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）培養基、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 大連美侖生物技術有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）（純度≥98%） 美國MP Biomedicals公司；HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）、ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、TritonX-114（純度≥99%） 美國Sigma公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、GSH-Px試劑盒 南京建成生物研究所。

1.2 儀器與設備

1384型生物安全柜、3111型CO2培養箱、石蠟切片機美國Thermo Forma公司；CFX96實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國Bio-Rad公司；AE-6450蛋白電泳儀美國ATTO公司；JS-680D全自動凝膠成像儀 上海培清科技公司；KZ-III勻漿儀 美國Servicebio公司；Cp70ne超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器公司；Nano ZS90激光粒度儀 美國Malvern Panalytica公司；SpectraMax ID3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；CARY50紫外-可見分光光度計 美國VAP公司；A1激光共聚焦顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 ΔSOD的制備與活力的測定

配制1.00 mg/mL的SOD溶液，于60 ℃水浴鍋中預熱1 h后，再75 ℃加熱1 h，得到粗納米SOD顆粒；經超濾和0.45 μm濾膜過濾后，得到ΔSOD，然后利用鹽酸羥胺法[22]測定SOD活力，并用于后續實驗研究。

1.3.2 ΔSOD在Caco-2細胞中的跨膜能力分析

將需要偶聯的SOD和ΔSOD蛋白用堿性碳酸反應液（17 g NaCO3和28 g NaHCO3溶解于1 L去離子水）透析1 h，然后分別取300 μL于盛有20 μL FITC 1.5 mL棕色EP管中，避光振蕩反應1 h；把標記好的蛋白樣品裝于1 mL的Sephadex G-25 Superfine凝膠柱中，洗脫后得到SOD-FITC和ΔSOD-FITC溶液[23,25]。將對數生長期的Caco-2細胞以4h 104個/孔接種于24 孔板中，在培養箱（37 ℃、5% CO2，下同）中孵育24 h，待細胞完全貼壁后吸棄培養液，然后每孔加入400 μL含0.50 mg/mL SOD-FITC或ΔSOD-FITC溶液的完全培養基，在培養箱中孵育3 h；取200 μL培養液于不透光的96 孔板中，用多功能酶標儀檢測細胞熒光強度，激發波長485 nm，發射波長535 nm。按照BCA試劑盒說明書測定細胞蛋白含量。以1 mg蛋白對應的熒光強度表征跨膜能力。

1.3.3 ROS水平的測定

取生長良好的Caco-2細胞接種于24 孔板和激光共聚焦培養皿中，在培養箱中孵育24 h，待細胞貼壁后，棄去培養液，加入400 μL含有500 U/mL SOD及ΔSOD的DMEM孵育3 h后，在避光條件下用培養基稀釋DCFH-DA探針至5 μmol/L，按照500 μL/孔加入含DCFH-DA的培養基，培養箱中繼續培養30 min后，每孔加入100 μL H2O2溶液（終濃度200 μmol/L）氧化刺激3 h后吸棄培養液，PBS清洗3 次，每孔加入250 μL細胞裂解液，振蕩2 min，4 ℃靜置15 min，常溫下1200 r/min離心5 min，取200 μL于不透光的96 孔板中，用多功能酶標儀檢測細胞熒光強度，激發波長485 nm，發射波長535 nm。按照BCA試劑盒說明書測定細胞蛋白含量，以1 mg蛋白對應的熒光強度表征ROS水平。參照上述方法處理激光共聚焦培養皿中的Caco-2細胞，并采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.4 ΔSOD脂質體的制備與包埋率的測定

采用逆向蒸發法制備L-ΔSOD。稱取一定量的ΔSOD凍干粉溶于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，使其終質量濃度為1 mg/mL；將質量比為4∶1的卵磷脂和膽固醇混合物按照質量比1∶3溶解于乙醚中，將上述有機相與ΔSOD溶液按照體積比3∶1混合，超聲處理6 min，形成穩定的油包水型乳液。將所得乳液于40 ℃下減壓旋轉蒸發以除去有機溶劑，形成乳濁液。獲得的乳濁液經過8000hg離心5 min，收集的上清液即為粒徑均勻的L-ΔSOD懸液，于4 ℃冰箱避光保存中備用[26]。將5 mL L-ΔSOD稀釋7 倍，4 ℃、100000hg離心10 min，收集上清液為游離的ΔSOD，利用BCA試劑盒測定其蛋白質量濃度，按照式（1）計算包埋率。

1.3.5 ΔSOD以及L-ΔSOD性質表征

采用激光粒度儀測定ΔSOD和L-ΔSOD的粒徑、ζ電位、多分散指數（polydispersity index，PDI）。

1.3.6 ΔSOD脂質體在模擬消化液中的降解情況

參考Brodkorb等[27]的方法配制含胃蛋白酶（2000 U/mL）、pH 2.0的模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）以及含胰蛋白酶（100 U/mL）、pH 7.0的模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF），將1.00 mg/mL ΔSOD與L-ΔSOD分別與SGF以體積比1∶3混合，于37 ℃振蕩水浴，并分別測定0、0.5、1.0、2.0 h時SOD活力/（U/mL），然后將模擬胃液消化2.0 h后的混合液與SIF以體積比1∶2混合后于37 ℃振蕩水浴120 min測定SOD活力/（U/mL）。SOD活力回收率按式（2）計算。

1.3.7 動物實驗

1.3.7.1 動物分組

將36 只ICR雄性小鼠適應性喂養7 d后開始動物實驗。將小鼠隨機分成2 組：正常組小鼠（6 只）飲用無菌水，模型組小鼠（30 只）自由飲用3.0 g/100 mL DSS溶液，連續飲用7 d，期間環境及飼養條件保持不變，在造模期間每天固定時間測定小鼠體質量、糞便形態及血便程度指標。造模結束后，進行疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分，并將模型組小鼠隨機分為5 組：模型組、SOD組、ΔSOD組、空白脂質體（L）組和L-ΔSOD組，每組6 只。各組分別灌胃0.02 mL/（gmbg d）滅菌水、SOD溶液、ΔSOD乳液、空白脂質體（不添加SOD）、L-ΔSOD乳液，SOD干預劑量50 U/（gmbg d），連續灌胃7 d，每天進行DAI評分。干預結束后，小鼠禁食禁水12 h，采用頸椎脫臼處死小鼠，解剖后收集直腸觀察并拍照，測定直腸長度同時收集小鼠脾臟和結腸。

1.3.7.2 疾病活動指數及結腸黏膜損傷指數測定

DAI可用于評估UC的嚴重程度，評分具體細則如表1[28-29]所示，每天固定時間稱量小鼠體質量、觀察糞便形態和血便情況，以3 項指標評分的平均值作為DAI評分。參考Wallace等[30]的結腸黏膜損傷指數（colonic mucosal damage index，CMDI）評分標準（表2）進行評價，并按照式（3）計算結腸密度。

表1 DAI評分標準[28-29]Table 1 Criteria for DAI scores[28-29]

表2 CMDI評分標準[30]Table 2 Criteria for colonic mucosal damage index (CDMI) scores[30]

1.3.7.3 小鼠脾臟系數測定

參照文獻[31]的方法，解剖小鼠取脾臟并稱質量，按式（4）計算脾臟系數。

1.3.7.4 結腸組織的蘇木精-伊紅染色

采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）試劑對質量分數4%多聚甲醛溶液固定的小鼠結腸組織進行染色處理。

1.3.7.5 結腸組織氧化指標的測定

取結腸組織按照1∶9（m/V）添加質量分數0.9%生理鹽水制備結腸組織勻漿，4 ℃、3000 r/min離心10 min，收集上清液備用。采用BCA試劑盒測定蛋白質含量。參考對應試劑盒說明書測定結腸組織中氧化應激相關指標MDA含量和GSH-Px活力。

1.3.7.6 促炎因子質量濃度的測定

參考對應酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書測定結腸組織中促炎細胞因子（腫瘤壞死因子（tumor necrosisi factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6與IL-1β）的質量濃度。

1.3.7.7 結腸組織緊密連接蛋白mRNA相對表達水平測定

使用TRIzol試劑提取小鼠結腸組織總RNA，使用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）試劑盒逆轉錄合成cDNA，再用ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑盒測定緊密連接蛋白基因（ZO-1和Occludin）mRNA相對表達水平，以正常組為對照，引物序列如表3所示。

表3 qPCR引物序列Table 3 Sequences of the primers used for real-time polymerase chain reaction

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2010軟件對數據進行處理分析，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 24軟件進行Duncan多重比較檢驗，P＜0.05表示差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 ΔSOD活力

SOD經過一定條件的加熱導致α-螺旋含量顯著減少、β-折疊和無序結構含量顯著增加而發生變性，從而使SOD聚集體絮凝成納米顆粒；天然的SOD活力為（26512.41±2732.09）U/mL，經2 h的加熱后得到ΔSOD活力比天然SOD提高了26.81%，可能具有更高的生物活性，SOD的每個亞基的活性中心是由β-折疊互相環繞而形成的活性通道[32]，ΔSOD活力更高可能是由于其中的β-折疊含量上升。

2.2 ΔSOD在Caco-2細胞中的跨膜能力

細胞受損后，胞內會產生大量的自由基，而細胞內有限的SOD無法達到清除效果，細胞需借助外源抗氧化物酶，使SOD與ROS維持平衡，才可以有效地清除細胞內的自由基。本實驗利用熒光標記的方法來評估ΔSOD的跨膜能力，由圖1可知，FITC標記的蛋白孵育Caco-2細胞3 h后，ΔSOD組跨膜能力顯著提高至SOD組的（2.89±0.20）倍（P＜0.05），表明ΔSOD比SOD具有更顯著的跨膜效果。有研究表明納米顆粒能附著在細胞膜上，細胞膜內陷形成小囊，顆粒會被包圍在小囊內，然后小囊從細胞膜上分離而形成小泡，通過內吞作用進入細胞內部；內吞作用包括吞噬和胞飲作用，當納米顆粒的直徑小于500 nm時，其通過胞飲作用進入細胞[33]。相比于SOD，ΔSOD因其納米性質具有的黏附細胞膜的能力，并由于其是納米級顆粒，能通過胞飲作用方式更多地跨膜進入細胞。

圖1 SOD和ΔSOD對Caco-2細胞跨膜能力的比較Fig.1 Comparison of transmembrane capacity SOD and ΔSOD for Caco-2 cells

2.3 ΔSOD的ROS清除能力

H2O2進入細胞發生Fenton反應產生大量的羥自由基，導致機體產生嚴重的氧化應激[34-35]。將Caco-2細胞分別與等濃度的天然SOD和ΔSOD混合進行孵育3 h，通過多功能酶標儀和激光共聚焦顯微鏡探究SOD和ΔSOD清除ROS的能力[22]。定量分析結果如圖2A所示，正常組與模型組中ROS水平具有顯著差異（P＜0.05），表明H2O2能刺激細胞產生大量的ROS。與模型組相比，SOD與ΔSOD ROS水平顯著降低（P＜0.05），且SOD與ΔSOD的ROS清除效果具有顯著性差異（P＜0.05）；如圖2B所示，模型組和SOD組因細胞產生了大量自由基而導致熒光強度很高。相比模型組，SOD和ΔSOD均可顯著降低熒光強度，而ΔSOD組熒光強度相對于SOD組弱，表明ΔSOD的清除效果更強。其原因是在相同蛋白質量濃度下ΔSOD比SOD活力高且具有更好的跨膜效果，因此ΔSOD更易進入細胞內發揮更強的自由基清除能力，進而更好地減弱熒光強度。目前關于SOD緩解UC癥狀的研究很多，但與已報道的從嗜熱菌中分離的超穩定的SOD[36]相比，本實驗的SOD納米顆粒制備簡單、酶活力高、細胞跨膜以及ROS清除能力強，具備顯著生物活性，因此有利于探究ΔSOD緩解UC癥狀的效果。

圖2 ΔSOD對由H2O2誘導Caco-2細胞產生ROS的清除效果Fig.2 Scavenging effect of ΔSOD on free radical produced by Caco-2 cells induced by H2O2

2.4 L-ΔSOD的性質表征

如表4所示，L-ΔSOD平均粒徑為（276.60±1.78）nm，ζ電位為（－31.30±0.14）mV，PDI為0.254±0.014。由于納米體系中ζ電位的絕對值越大，表明體系越穩定，因此ζ電位可作為考察納米顆粒穩定性的指標[37]。因此，與ΔSOD（（－11.44±1.17）mV）相比，L-ΔSOD具有較高的穩定性；L-ΔSOD的包埋率為（29.72±0.01）%，能夠對ΔSOD起到一定的保護作用。

表4 L-ΔSOD的性質Table 4 Characteristics of L-ΔSOD

2.5 L-ΔSOD體外模擬胃腸道的穩定性

如表5所示，在SGF的作用下，ΔSOD的活力迅速降低，0.5 h后幾乎全部失活，這表明ΔSOD易受到胃酸和胃蛋白酶的破壞與降解[13,38]。而ΔSOD經脂質體包埋可以減少酶活力的損失，L-ΔSOD活力為（3157.75±206.12）U/mL，經過體外胃腸液消化后的Δ S O D 活力為（1278.23±15.01）U/mL，酶活力回收率為40.90%，表明脂質體對胃腸液在一定程度上具有耐受性，有利于研究口服ΔSOD脂質體對UC癥狀的作用效果[39]。

表5 ΔSOD和L-ΔSOD模擬消化后的活力及其活力回收率Table 5 Residual activity and activity recovery rate of ΔSOD and L-ΔSOD after simulated digestion

2.6 L-ΔSOD對UC小鼠DAI評分的影響

DSS破壞結腸黏膜屏障，導致腸道炎癥發生、出現體質量減輕、便血便稀等臨床癥狀，DAI評分是評價結腸炎嚴重程度的一個指標。如圖3所示，經7 d造模后，除正常組外，其余各組DAI評分均維持在一定水平，表明造模成功。以不同樣品灌胃干預7 d后，各樣品均可以不同程度地降低小鼠DAI評分。與模型組相比，樣品組以不同程度降低小鼠的DAI改善小鼠UC，緩解小鼠便血便稀等病理學特征。其中樣品組緩解UC模型小鼠的病理學特征作用依次為L-ΔSOD＞ΔSOD＞SOD＞空白脂質體。

圖3 小鼠灌胃階段DAI（A）與第14天DAI（B）評分Fig.3 DAI score during intragastric administration (A) and DAI score on the 14th day (B)

2.7 L-ΔSOD對UC小鼠結腸組織形態的影響

當小鼠結腸遭DSS損傷時，結腸容易發生充血腫脹現象，其中CMDI可以反映結腸大體損傷程度，同時從形態學角度分析L-ΔSOD對UC小鼠的改善情況。如圖4A所示，正常組結腸組織呈均勻細長狀，腸壁細膩光滑有彈性，無充血腫脹現象；模型組的結腸組織呈充血腫脹狀態，近盲腸端腫脹尤為明顯，腸壁質地脆弱且極易斷裂，肉眼可見盲腸與結腸內含血性不成形的糞便內容物[40]；樣品組的結腸組織形態相比于模型組均有不同程度的好轉，結腸充血現象且腫脹程度大幅減輕，腸壁質地恢復一定的彈性且不易斷裂尤其是L-ΔSOD組結腸已接近正常結腸組織形態。如圖4B所示，與模型組相比，樣品組的CMDI均下降，其中樣品組降低小鼠CMDI的能力依次為L-ΔSOD＞ΔSOD＞SOD＞空白脂質體，表明L-ΔSOD恢復結腸組織形態為最佳。

圖4 小鼠結腸組織形態（A）和小鼠CMDI評分（B）Fig.4 Morphology (A) and CMDI score (B) of mouse colon tissue

2.8 L-ΔSOD對UC小鼠結腸長度和密度的影響

DSS誘導的UC模型容易發生纖維化導致結腸長度縮短和結腸密度升高，可通過結腸長度和密度評估樣品改善UC的效果。由圖5可知，與模型組相比，樣品組結腸長度增加，結腸密度降低，其中ΔSOD和L-ΔSOD改善效果最顯著（P＜0.05），而空白脂質體的干預對其無顯著影響（P＞0.05）。

圖5 小鼠結腸長度（A）和結腸密度（B）Fig.5 Length (A) and density (B) of mouse colon tissue

2.9 L-ΔSOD對UC小鼠脾臟系數的影響

脾臟作為機體的免疫器官，當機體發生UC炎癥時脾臟會腫大，因此脾臟系數能從側面評估L-ΔSOD改善UC的療效。如圖6所示，與模型組相比，樣品組的脾臟系數均顯著降低（P＜0.05），其中樣品組降低UC模型小鼠脾臟系數的能力依次為L-ΔSOD＞ΔSOD＞SOD＞空白脂質體，且L-ΔSOD組的脾臟系數顯著低于SOD組（P＜0.05），表明SOD通過自組裝和脂質體包埋后能更有效地改善UC。

圖6 小鼠脾臟系數Fig.6 Spleen index of mice

2.10 L-ΔSOD干預后UC小鼠結腸組織切片染色觀察結果

如圖7所示，正常組小鼠結腸的黏膜上皮細胞結構完整，無腫脹現象，隱窩結構規則，腸絨毛結構完整，杯狀細胞含量高。模型組小鼠結腸糜爛，腺體結構破損，隱窩結構呈不規則狀態，腸絨毛變形破損，杯狀細胞缺失，伴有大量炎癥細胞浸潤。與模型組相比，SOD、L、ΔSOD組和L-ΔSOD組均有明顯修復，其中ΔSOD組與L-ΔSOD組修復效果更加明顯，結腸表現和正常組相似。說明各樣品組對DSS誘導的UC模型中均有修復作用，各樣品修復UC模型小鼠的結腸狀態的效果依次為L-ΔSOD＞ΔSOD＞空白脂質體＞SOD。

圖7 小鼠結腸組織病理切片HE染色結果（200×）Fig.7 Hematoxylin-eosin staining results of pathological sections of mouse colon tissue (200 ×)

2.11 L-ΔSOD對UC小鼠的結腸抗氧化指標的影響

GSH-Px具有抗氧化作用，在機體中作為質子供體清除H2O2以及脂質氫過氧化物。氧化應激會引起細胞膜的脂質過氧化，而MDA是脂質過氧化的終產物之一[41]。如圖8所示，相比模型組，L-ΔSOD中的GSH-Px活力顯著增加（P＜0.05），MDA含量明顯降低，說明L-ΔSOD在一定程度上能有效改善UC氧化應激。

圖8 小鼠結腸內GSH-Px活力（A）和MDA含量（B）Fig.8 GSH-Px activities (A) and MDA contents (B) in mouse colon

2.12 L-ΔSOD對UC小鼠結腸炎癥因子質量濃度的影響

DSS誘導的UC模型會有大量炎性細胞浸潤至結腸黏膜固有層，炎性介質使巨噬細胞轉化為促炎表型從而被激活，產生大量促炎細胞因子如TNF-α、IL-6以及IL-1β[42]。如圖9所示，相對于模型組，樣品組均可以不同程度地降低促炎性因子釋放量，其中以ΔSOD和L-ΔSOD效果最顯著（P＜0.05），表明兩種樣品均可以通過降低促炎性因子釋放量、減輕促炎性因子浸潤來改善UC。

圖9 小鼠結腸內TNF-α（A）、IL-6（B）以及IL-1β（C）質量濃度Fig.9 TNF-α (A),IL-6 (B) and IL-1β (C) contents in mouse colon

2.13 L-ΔSOD對UC小鼠的結腸緊密連接蛋白mRNA相對表達水平的影響

有缺陷的腸上皮緊密連接屏障是導致UC發展的重要因素，緊密連接（tight junction，TJ）中的兩種關鍵蛋白ZO-1和Occludin是腸道屏障的重要組成部分，可通過調節上皮細胞的屏障功能和腸道屏障的選擇通透性來預防炎癥發生[43-44]。如圖10所示，DSS誘導的UC模型小鼠中ZO-1和Occludin表達量顯著降低，表明UC模型小鼠腸黏膜屏障受到損傷。L-ΔSOD組可以顯著促進ZO-1和Occludin表達（P＜0.05），結合小鼠總體狀態，結果表明L-ΔSOD可以通過促進ZO-1和Occludin表達來修復腸黏膜屏障損傷，進而改善UC。

圖10 小鼠結腸組織內ZO-1（A）和Occludin（B）mRNA相對表達水平Fig.10 Relative mRNA expression levels of ZO-1 (A) and Occludin-1 (B)in mouse colon tissues

3 結論

本實驗利用SOD加熱自組裝形成ΔSOD納米顆粒，其活力較天然SOD提高26.81%；FITC熒光標記實驗結果表明ΔSOD跨膜能力是天然SOD的（2.89±0.20）倍；通過多功能酶標儀和共聚焦顯微鏡探究SOD和ΔSOD清除ROS能力，結果表明ΔSOD清除由H2O2誘導Caco-2細胞產生的ROS的能力更強。利用逆向蒸發法制備的ΔSOD脂質體的包埋率為（29.72±0.01）%，模擬胃腸道穩定性實驗結果顯示包埋于脂質體內的ΔSOD在模擬胃腸道中的保留率達到40%左右，有利于口服L-ΔSOD緩解UC癥狀。在動物實驗中，使用DSS對小鼠造模，造模成功后，利用SOD、ΔSOD、空白脂質體和L-ΔSOD進行灌胃實驗。結果顯示：樣品組均可降低UC模型小鼠的DAI評分，恢復結腸長度、降低結腸密度和CMDI評分，與模型組相比空白脂質體和SOD組均無顯著性差異，而ΔSOD和L-ΔSOD均有顯著性改善（P＜0.05）；通過結腸組織病理切片分析，樣品組可以恢復UC模型小鼠黏膜上皮細胞結構完整性，增加杯狀細胞含量以及修復隱窩結構和腸絨毛結構，減輕炎性細胞在黏膜下層的浸潤，其中L-ΔSOD修復效果最為顯著，基本達到與正常組相似水平；同時L-ΔSOD可以降低結腸組織MDA含量、降低結腸組織中的TNF-α、IL-6與IL-1β等促炎細胞因子質量濃度，減輕結腸組織過氧化損傷；提高結腸組織GSH含量和ZO-1和Occludin相對表達水平，進而提高結腸組織抗氧化以及腸道屏障功能，降低腸道內氧化應激，發揮保護腸道、抑制炎癥作用。

綜上所述，灌胃L-ΔSOD相比于SOD、ΔSOD對于DSS誘導的UC模型小鼠有著更優異的炎癥緩解效果，這可能是因為SOD經過自組裝后形成的納米顆粒具有更高的酶活力和穩定性，賦予其更強的自由基清除能力，并且脂質體對ΔSOD有良好的保護作用，使ΔSOD在胃腸道刺激下能保持良好的酶活力。因此，L-ΔSOD作為食品功能因子通過飲食干預進行預防和緩解UC癥狀是具有良好的應用前景。此外，目前的研究僅限于DSS誘導的小鼠急性結腸炎，還需要在其他臨床UC模型中進行驗證。總之，這些結果表明SOD經過自組裝形成的納米顆粒有良好的生物利用度。本研究可促進基于ΔSOD作為食品功能因子在許多其他炎癥性疾病中的應用。