細胞生物傳感器在食品風味評價中的研究進展

郭程琳，樊玉霞，陳高樂，劉登勇，劉 源,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

隨著國民生活水平的提高，消費者對食品品質的要求從單一的滿足營養需求提升到兼顧食品風味。食品風味是食品品質的重要評價指標之一，也是區分不同食品的重要特點。人體通過味覺和嗅覺對食品風味進行評價，不是基于某種單一感覺，而是味覺、嗅覺和三叉神經綜合作用的結果，常被消費者用作判斷食品品質的指標[1]。

目前，基于味覺或嗅覺感知原理的食品風味評價常規方法主要包括人工感官和智能感官評價，儀器分析技術則主要用于分析食品中滋味及揮發性風味物質。人工感官評價是指經過專業培訓的感官評價人員對食品風味特性進行評價分析，其作為風味評價最直接的方法，具有分析速度快、成本低的優點；但對感官評價人員專業性有要求，也會受個體主觀性及其他因素（年齡、地域等）影響，人工感官評價方法的應用在一定程度上受到限制，感官特征的量化分析仍有待解決。常用的儀器分析方法如高效液相色譜、液相色譜-質譜聯用、氣相色譜、氣相色譜-嗅聞計等能實現食品中多種目標風味成分的定量檢測，但無法揭示物質的味覺、嗅覺信息，也不能實現味覺、濃度與強度的綜合評價。智能感官評價是指包括電子鼻、電子舌和機器視覺系統在內的多種智能感官儀器，通過模擬嗅覺、味覺和視覺系統功能，基于多傳感器獲得目標風味物質特征信號，結合模式識別方法實現感官的評價。相對人工感官評價，智能感官評價減少了人員培訓、避免了主觀性等因素的影響，但該方法無法取代味覺系統（從舌頭到大腦）對風味物質的綜合信息進行響應，并且構建傳感器的敏感材料對特殊離子的吸附催化作用極大程度地影響了其對目標物質的分析檢測能力[2]。

基于生物傳感器對食品風味進行評價已成為近年來國內外學者的研究熱點之一[3-4]。基于酶催化氧化還原反應的酶傳感器已逐步應用于味覺化合物檢測，主要集中在鮮味和甜味分析方面[5-7]。以味覺組織、受體等[8-10]為敏感材料的生物傳感器與酶傳感器相比，敏感元件可從自然界中獲得，使用壽命也相對較長。味蕾組織的開發及使用使生物傳感器在風味分析中的應用更加多元[11-12]。隨著微生物固定化技術的發展，微生物傳感器也逐步應用于風味分析、安全監測中，如對乙醇進行靈敏測定，檢測咖啡因、霉菌毒素等化合物[13]。細胞尤其是味覺細胞，被普遍認為是構建味覺生物傳感器的生物功能元件。目前，基于不同細胞作為生物敏感元件已開發出多種類型的傳感器，可用于食品風味物質的評價分析。因此，本文旨在簡明闡述細胞生物傳感器概況，綜述基于不同味覺和嗅覺細胞的生物傳感器在食品風味評價中的研究進展，并對未來的研究方向進行展望。

1 細胞生物傳感器簡介

細胞生物傳感器采用固定或未固定的生物活細胞作為傳感器的敏感元件識別目標分析物，通過換能器實現信號處理，獲取目標分析物的特征信息，通常信號響應特征與目標分析物存在一定規律的關聯性，從而實現有效評價[14]。細胞生物傳感器系統一般由3 個主要元件組成，包括一級感受器，即敏感元件，及兩個二級感受器，即換能器和信號處理系統。根據細胞類型可將細胞傳感器分為兩大類：一是微生物細胞傳感器，以細菌、真菌、酵母和藻類作為敏感元件；二是動物細胞傳感器，以高等真核細胞為敏感元件，如魚類、大鼠、人體細胞等。隨著細胞生物傳感器的不斷發展，其在環境監測、醫學診斷、制藥、食品分析等方面的應用也在不斷突破[15]。本文重點關注細胞生物傳感器在味覺及嗅覺評價中的研究進展。圖1所示為典型的細胞生物傳感器構建及其在不同風味物質分析中的應用。

圖1 典型細胞生物傳感器示意圖及其應用Fig.1 Schematic diagram of typical cell-based biosensors and their application

2 細胞生物傳感器在味覺物質檢測中的研究進展

已有研究表明，除味覺細胞外，其他細胞也能實現風味物質的識別，因此基于細胞生物傳感器對味覺物質的檢測在過去幾十年中得到迅速發展[19-21]。用于味覺物質檢測的細胞生物傳感器，根據敏感元件不同主要分為味覺細胞傳感器、鼠精細胞傳感器、腸內細胞傳感器、心肌細胞傳感器。

2.1 基于味覺細胞的生物傳感器

味覺系統能夠辨識甜、苦、酸、咸、鮮5 種基本味型，其原理是味覺受體與味型分子結合后，味覺細胞膜去極化，釋放神經遞質，所產生信號經神經系統轉化后傳入大腦而作出響應。因此，選擇味覺細胞作為生物傳感器敏感元件是表達味覺信號最有效的方法之一。根據超微結構特征、基因表達模式與細胞功能，味覺細胞可分為3 種類型，即I型細胞、II型細胞和III型細胞，其結構如圖2所示[22]。甜味、苦味和鮮味均由II型味覺細胞感受[23-24]，其中味覺受體T1R2和T1R3結合形成甜味受體，T2Rs為苦味受體，T1R1和T1R3結合形成鮮味受體；III型細胞感知酸味刺激[25-26]；而咸味刺激（NaCl）的感知味覺細胞尚未確定[27]。

圖2 味蕾結構示意圖[22]Fig.2 Schematic diagram of taste bud structure[22]

味覺細胞是味覺生物傳感器常用的生物傳感元件，作為敏感元件的細胞源具有靈敏識別信號并準確傳導的優勢[5]。味覺細胞來源于味蕾，但原代味覺細胞的培養相對困難，對微環境要求較高，且體外生存繁殖能力較弱[28]。因此，可以使用味覺干細胞培養類器官，體外分化味覺細胞作為敏感元件，將完好的味覺細胞作為基本的味覺感知單元[29]，可以在體外最大限度地模擬真實的味覺和細胞內信號轉導[30]，能更直接感受味覺物質的刺激，這是實現味覺細胞傳感器構建的基礎。但類器官的培養也具有一定難度，同時存在培養出的味覺細胞種類難以控制、類器官中味覺細胞比例小及存活時間短等問題，一定程度上限制了味覺細胞傳感器的發展。

在傳感器的搭建中，為記錄神經元的細胞外電位，研究人員利用不同的二級感受器，如場效應晶體管（field effect transistor，FET）陣列、MEA、光尋址電位傳感器（light addressable potential sensor，LAPS）、玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）等感受器[31]，來實現信號記錄和放大。其中MEA和FET適用于長期檢測，但它們的記錄位點僅限于電極或柵極位點。

表1總結了近年來基于味覺細胞傳感器在味覺物質評價中的應用。通過構建味覺細胞傳感器對不同甜味、苦味、酸味物質進行評價，反映出味覺細胞傳感器檢測種類多元、靈敏度高等優勢，但仍存在敏感元件獲取困難、穩定性低、難以大量推廣等缺陷。與將其用作味覺物質分析儀器相比，將細胞傳感器開發成生物傳感模型更為合理，可以使其在味覺系統的基礎理論研究中具有更好的靈敏度和選擇性[32-33]。

表1 基于味覺細胞的傳感器研究及應用Table 1 Research and applications of sensors based on taste cells

2.2 基于鼠精細胞的生物傳感器

研究發現人和小鼠基因組中包含成對的直系苦味受體基因，Xu Jiang等[40]研究也證實了苦味受體基因在小鼠睪丸組織中大量表達。苦味受體基因在整個進化過程中都得到了保留，能夠識別多種苦味化學物質[41-43]。小鼠睪丸中存在大量游離生殖細胞，因此作為細胞傳感器敏感元件的細胞源具有顯著數量來源優勢。田玉蘭[44]利用鼠精細胞作為敏感材料，根據細胞阻抗傳感原理制備的傳感器可以對苦味物質進行特異性檢測。該實驗探究了不同細胞密度下精細胞阻抗傳感器的靈敏度，確定最佳細胞密度為4h 106個/mL；通過苦味濃度測試確定苯硫脲和奎寧兩種苦味物質的檢測范圍分別為10～200 μmol/L和62.5～1000 μmol/L，檢出限分別為4 μmol/L和40 μmol/L；此外，還發現傳感器阻抗值增量與苦味物質濃度呈一定線性相關性。該方法結合了鼠精細胞對苦味物質特異性響應和細胞阻抗傳感器能夠實時無侵入測量細胞生理生態變化的特點，為苦味物質檢測提供了一種新的思路。Hu Liang等[18]利用細胞阻抗的原理構建基于小鼠精細胞的苦味生物傳感器，研究4 種苦味化合物的細胞阻抗響應，同時探究該細胞傳感器對其他基本味覺的檢測可行性。結果表明，該細胞傳感器只對苦味存在特異性，對其他味覺物質無信號響應，為混合味覺物質中的苦味特異性檢測提供了一種新思路。Tian Yulan等[45]構建了一種基于精子細胞的新型生物傳感器，該傳感器以小鼠活精子細胞為主要敏感元件，采用細胞內鈣離子熒光探針（Fluo4-AM）作為傳感器，并結合流式細胞術，實現了苦味化合物的快速定量檢測；同時采用主成分分析法對3 種苦味物質進行分類，實現了苦味的定性評價與分類。精子細胞傳感器表現出方法簡便、價格低廉、靈敏度高、特異性強、檢測限低等特點。但目前精子細胞傳感器多用于苦味檢測，應用范圍有限，并且若使用細胞阻抗原理檢測，傳感器對外界味覺刺激響應緩慢，限制了味覺化合物的快速識別。因此，開發新的檢測方法提高傳感速度是精子細胞傳感器商業化應用的一個突破方向。

2.3 基于腸道細胞的生物傳感器

近年來，越來越多的研究人員對腸道細胞中味覺受體的表達機理進行闡釋，發現小鼠、大鼠和人體的腸道內部均有甜味、苦味、鮮味受體表達。苦味物質在人結腸中可以通過苦味受體T2Rs進行識別，其中包括T2R3、T2R4、T2R5、T2R10、T2R13、T2R38、T2R39、T2R40、T2R43、T2R44、T2R435、T2R46、T2R47、T2R49、T2R50和T2R60[46]。鮮味物質可以通過T1R1與T1R3異源二聚體進行識別[47-49]，甜味物質可以通過T1R2與T1R3異源二聚體進行識別[50-52]。基于腸道細胞表達味覺受體的特點，以其為敏感材料的傳感器也開始受到關注。表2總結了近年來基于腸道細胞的傳感器及其應用。已有研究報道，NCI-H716和STC-1細胞多被用作腸道細胞敏感元件，構建阻抗傳感器，且多數結果表明兩種細胞可實現苦味和甜味物質的選擇性識別[53-55]，并可以進行定量檢測[56]。Hui Guohua等[57]在碳絲網印刷電極上分別培養NCI-H716和STC-1細胞，構建兩種細胞傳感器，結果表明，NCI-H716細胞傳感器可以區分13 種甜味劑混合物和7 種含蔗糖的促味劑混合物，對蔗糖的檢測范圍為0.71h 10－1～2h 10－1mol/L；STC-1細胞傳感器可以檢測7 種不同濃度的奎寧促味劑混合物，對奎寧的檢測范圍為2.6h 10－5～5h 10－5mol/L。此類型傳感器通過培養特定腸道細胞作為敏感元件構建傳感器，相對容易，并且因其響應速度快、靈敏度高、選擇性強等特點而受到關注[58-60]。但目前的研究僅對部分甜味和苦味物質進行了評價，并且分析檢測前必須對檢測條件進行優化，如信號放大、特征提取等；此外，在檢測時還需通過一些生物學方法驗證信號是由味覺物質結合到選擇性味覺G蛋白偶聯受體介導引起，未來還需進一步深入研究識別機制，拓展其應用范圍。

表2 基于腸內細胞的傳感器及應用Table 2 Applications of sensors based on intestinal cells

2.4 基于心肌細胞的生物傳感器

最新研究表明味覺受體不僅能在味覺系統中表達，也在大鼠心肌細胞中進行表達[61]。味覺受體的廣泛表達為生物傳感器的構建提供了多種可能性。Wei Xinwei等[62]首次以大鼠心肌細胞為敏感元件，以MEA為次要傳感器，記錄體外心肌細胞的電生理信號，開發了一種基于仿生體外細胞的苦味和鮮味檢測系統。結果表明，心肌細胞附著于傳感器表面，生長情況良好，它們形成的合胞體進行電位傳導和機械跳動，表明表面涂層具有良好的生物相容性；通過對苦、甜、酸、咸、鮮不同味覺成分進行生物特異性驗證，并采用主成分分析對不同味覺成分進行鑒別，實現了對兩種苦味物（苯甲地那銨、地芬尼多）和鮮味化合物（谷氨酸鈉）的特異性檢測，其中苯甲地那銨的檢測范圍為1.0h 10－5～6.4h 10－4mol/L、檢出限為3.46h 10－6mol/L，地芬尼多的檢測范圍為5.0h 10－6～3.2h 10－4mol/L、檢出限為2.92h 10－6mol/L，谷氨酸鈉的檢測范圍為1h 10－6～4h 10－3mol/L、檢出限為1.6h 10－6mol/L。該研究基于心肌細胞和MEA構建的味覺細胞傳感器是一種全新的味覺檢測方法，在區分苦味和鮮味化合物方面表現出良好的特異性。需要指出的是，位于心肌中的大部分G蛋白偶聯受體的準確作用機制尚不完全清楚，未來仍需探討。體內G蛋白偶聯受體的廣泛存在為味覺生物傳感器提供了豐富的替代傳感元件，基于心肌細胞的傳感器在味覺檢測和藥物研究方面都具有良好的應用前景。

3 細胞生物傳感器在氣味物質檢測中的研究進展

嗅覺傳感器技術可以模擬人類嗅覺器官，實現對氣味物質的評價。近年來，基于嗅覺細胞生物傳感器的研究得到了廣泛關注，并普遍應用于生物醫學、食品、藥品、環境保護等諸多領域[63-65]。根據作為敏感元件的細胞來源不同，用于氣味物質檢測的細胞生物傳感器主要劃分為以下3 類：脊椎動物嗅覺細胞傳感器、昆蟲受體細胞傳感器、異源細胞傳感器。

3.1 基于脊椎動物嗅覺細胞的生物傳感器

脊椎動物的嗅覺細胞能夠以極高的靈敏度識別不同氣味物質，已被越來越多的研究者認為是開發細胞傳感器的潛在對象。在嗅覺上皮中嗅覺細胞的軸突形成嗅神經，其中的嗅覺神經元擁有數以千計的嗅覺受體，能感受不同類型氣味的刺激。因此，基于脊椎動物嗅覺細胞的嗅覺傳感器具有強特異性、高靈敏度和快速響應等特點，是嗅覺傳感器的理想生物材料[66]。Liu Qingjun等[67]通過將嗅覺細胞固定在LAPS的表面上構建了生物電子鼻。利用醋酸、丁二酮進行刺激測試，結果表明LAPS檢測到嗅覺上皮中受體細胞的細胞外電位發生變化，通過主成分分析也可對醋酸、丁二酮進行區分。此類系統具有作為檢測醋酸、丁二酮等氣味的嗅覺生物傳感器神經元芯片的潛力。但通常嗅覺細胞直接固定在換能器表面，導致細胞隨機分布，且細胞與換能器耦合不可控。這種明顯的缺陷導致這類仿生嗅覺細胞的生物傳感器的性能和應用受到各種限制，因此如何實現嗅覺細胞與傳感器的可控、高效耦合也是提高嗅覺細胞傳感器性能面臨的挑戰之一。Du Liping等[68]采用DNA定向位點特異性細胞固定化方法，為細胞隨機分布問題提供了新的解決方案。該方法以大鼠嗅覺細胞為敏感元件，MEA芯片為傳感器，細胞在質膜上與單鏈DNA共價連接，而互補的單鏈DNA則以確定的圖案印在支持物表面，由此控制細胞固定在固體支持物表面，以形成理想的細胞模式。通過辛醛和乙醛刺激嗅覺細胞傳感器，有效監測嗅覺細胞的膜電位變化，進而監測傳感器的響應。此方法不僅可以實現嗅覺細胞與MEA的可控位點特異性偶聯，固定化的嗅覺細胞可以在傳感器表面形成理想的分布，并對特定的氣味刺激（辛醛和乙醛）作出響應；還可以極大提高耦合效率，增強嗅覺細胞傳感器的穩定性。基于此，未來也可以將不同堿基序列的ssDNA附著在不同的嗅覺細胞上，構建化學傳感微細胞陣列。但此類嗅覺傳感器所獲得的信號響應是多個嗅覺受體電信號的疊加，可能會給后期數據分析帶來一定困難。

3.2 基于昆蟲受體細胞的生物傳感器

科學家已從果蠅、蚊子、蛾、甲蟲等多種昆蟲物種中鑒定出100多種氣味受體的功能特征[69-71]。這些昆蟲氣味受體可選擇性地感知不同類型的氣味物質，包括醇、醛、酮、酸、烴和芳香族化合物[72]。Mitsuno等[73]使用昆蟲細胞（Sf21細胞系）作為氣味傳感器元件，通過鈣成像將細胞響應轉化為非侵入性、可視化的熒光強度，并采用該氣味傳感器對(E,Z)-10,12-十六碳烯醇、反-10,順-12-十六碳二烯醛進行測定；結果表明，異源蛋白基因穩定整合到細胞系基因組中，細胞能穩定表達昆蟲氣味受體并選擇性區分不同氣味。鈣成像技術可防止對細胞造成機械損傷，能夠在約13 s內作出快速響應；該方法不僅克服了基于細胞的生物傳感器（如使用爪蟾卵母細胞的氣味傳感器[74]）壽命短的問題，其響應檢測性能可保持至少2 個月，還極大增強了穩定性。目前，雖然可以構建多個表達不同嗅覺受體的氣味傳感器細胞系，但將多個細胞系集成到氣味傳感器陣列的方法尚未開發出。基于此種設想，Termtanasombat等[75]為在同一表面將多種細胞系結合，使用細胞圖案化技術創建了具有多氣味傳感器細胞系陣列模式的氣味傳感器（圖3），其原理同樣是利用Sf21細胞系作為氣味傳感器元件，通過熒光強度反映對目標氣味的響應。使用圖案化的聚二甲基硅氧烷膜模板和細胞固定試劑，成功創建了表達Or13a、Or56a、BmOR1和BmOR34 種細胞系的陣列圖案。通過檢測1-辛烯-3-醇、土臭素、(E,Z)-10,12-十六碳烯醇和反-10,順-12-十六碳二烯醛氣味物質，證明了傳感器能夠區分多個目標氣味。基于此類昆蟲受體的細胞傳感器具有穩定性好、可用響應檢測時間長、可以表達多個細胞系受體、能夠辨別多種氣味的優點，但仍存在與其他類型細胞傳感器類似的共性問題，包括復雜耗時的前處理工作流程，最終受體表達效率低，溫度、濕度等環境條件可能會影響傳感器的性能，傳感器的最終構建成本高等，從而限制了此類傳感器的商業化應用。

圖3 基于細胞的氣味傳感器陣列開發示意圖[75]Fig.3 Schematic diagram of cell-based odor sensor array development[75]

3.3 基于異源細胞的生物傳感器

近10 年，許多研究者對嗅覺受體蛋白在異源細胞系統中的表達進行了嘗試[76]。將某些嗅覺受體與其他生物材料（如細胞）通過人工方式進行轉導系統的結合，并利用物理、化學探測器或傳導微系統進行信號的表達，從而達到嗅聞的目的。研究表明，幾種受體蛋白可通過大腸桿菌細胞[77]、酵母細胞[78-79]和爪蟾卵母細胞[80]等系統進行表達。表3總結了部分異源細胞來源嗅覺傳感器的研究進展。與其他類型的嗅覺傳感器相比，異源細胞傳感器可在細胞質膜上僅表達一種所需類型的嗅覺受體，且其具有更好的維持嗅覺受體天然結構的特異性。此外，異源細胞傳感器允許標記的轉接，有助于嗅覺受體的有效固定[77,81]。但研究也發現異源細胞生物傳感器構建中的一些問題，如基于表達的嗅覺受體生產耗時、勞動密集且效率相對較低等。此外，該方法的產物會含有一些不相關的蛋白質，需要額外的純化。在表達嗅覺受體蛋白的功能分析方面也存在許多困難，如何做好細胞的抗凋亡策略也是異源細胞生物傳感器研究面臨的一個重要問題[82]。

表3 基于異源細胞的嗅覺傳感器研究進展Table 3 Recent research progress on olfactory sensors based on heterologous cells

4 結語

從近幾十年基于細胞的生物傳感器發展來看，對細胞傳感器作用機理的研究為新型細胞傳感器在食品風味評價中的應用提供了理論依據。細胞傳感器在食品風味評價方面表現出巨大的優勢以及可觀的發展前景。然而細胞傳感器完全應用于風味評價仍然面臨極大的挑戰。目前基于細胞生物傳感器應用的瓶頸主要分為3 個方面：1）細胞對微環境要求較復雜，原代培養較為困難。為解決這一技術難題，研究者通過干細胞培養類器官，體外分化為所需細胞，但其培養過程相對復雜，培養出的細胞也存在表達信號弱等問題；此外，通過構建能夠表達特定味覺受體的人工細胞系進行異源蛋白表達，但人工細胞系是否能完全替代天然細胞的傳感系統卻不得而知。2）細胞傳感器雖已建成但是仍難以滿足多樣化分析，發掘能夠多樣化表達的細胞有助于多功能細胞傳感器的研究。3）細胞存在凋亡等問題，細胞傳感器保存時間不長，長期儲存后性能穩定性降低。降低成本與細胞傳感器保持長時間穩定表達往往不能兼得，如何在降低成本的同時延長保存時間，也是細胞傳感器在食品評價中能否實際應用的決定性問題。因此，在未來研究中，推動細胞傳感器在關鍵味覺、嗅覺活性化合物篩選中的應用是食品風味評價方法的重要方向之一；3D/4D細胞培養可為細胞生長提供穩定的環境，以期其在味蕾細胞培養中應用，為細胞傳感器敏感元件選擇提供保障；增強細胞與次級傳感器之間的耦合是提高傳感器穩定性的一個良好思路，采用新形式電極可以促進電極與細胞之間信號轉導，例如碳納米纖維電極，改進味覺細胞培養方法、促進細胞電極耦合均是提高細胞生物傳感器性能的有效策略。在應用方面，開發便攜、多功能的細胞傳感器，實現對食品風味物質的分析以及各種氣味、滋味物質的準確識別，將具有廣闊的市場應用前景。細胞傳感器可與智能終端結合，實時、有效地對風味信息進行采集。在此基礎上與人工感官結合，進行相關分析并建立數據庫，為味覺、嗅覺評價建立統一的感官評價方法或評價標準。總之，以味覺及嗅覺感知機制研究為基礎，基于細胞生物傳感器的食品風味評價將為智能感官技術的發展提供一定理論依據。細胞生物傳感器的發展促進了味覺、嗅覺系統相關理論的研究，在食品風味評價領域具有重要意義，在未來食品風味研究中將取得更大突破。