花色苷與蛋白質相互作用的研究進展

藏志煥，丑述睿，唐思懿，李芝穎，田金龍，李 斌

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

花色苷是一種天然水溶性色素，屬于黃酮多酚類化合物[1]，存在于植物的花、果實、莖、葉和根器官的細胞液中?；ㄉ兆鳛槭澄镏械囊环N常見成分，可以通過攝入蔬菜、水果、葡萄酒和其他食物適量補充[2]?；ㄉ盏念伾SpH值變化而變化，當pH值由酸性變為堿性時，其顏色由紅色、紫色變為藍色（圖1A）?；ㄉ盏陌踩珶o毒性使其在食品工業中被廣泛應用于賦予或改善加工產品的顏色[3]。除顏色外，由于花色苷具有抗氧化、抗炎，抗腫瘤及保護視力等功效[4]，常被用于醫藥、食品、化妝品等領域[5]。從結構上看，花色苷來源于花青素，由芳香環、含氧雜芳香環和芳香環組成[6]（圖1B）。在植物中主要包括以下6 種花青素，即矢車菊素、芍藥素、天竺葵素、矮牽牛素、錦葵素和飛燕草素[7]（圖1C）。室溫條件下花色苷結構在不同pH值水溶液中相互轉換，結構之間存在著一定的平衡，分別為黃烊陽離子（紅色）、醌類（紫色到藍色）和無色形式（甲醇假堿和查耳酮）[4]。但花色苷在水溶液中極易受到水分子的親核攻擊，2-苯基苯并吡喃陽離子發生羥基化而發生降解。影響穩定性的因素主要有pH值、光照、溫度、酶和糖等[8]。因此，針對花色苷的穩態化研究是目前亟需解決的熱點問題。

圖1 花色苷的顏色變化、花青素結構及花青素種類、取代基和顏色Fig.1 Color change of anthocyanins,the structure of anthocyanin and anthocyanin types,substituents and color

為了提高花色苷的穩定性，前人已經研究和開發了幾種方法，如共著色、結構修飾和微膠囊等[9-11]，但均存在得率低、安全性差、色澤不易保持等問題[12]。研究表明，蛋白質具有良好的表面性質、自組裝性能和凝膠化特性，可在不改變花色苷結構的情況下，通過非共價和共價的作用形成結合體，花色苷固定在蛋白質結構腔中，可減少吡喃陽離子的損失，從而對花色苷的穩定性產生積極影響[13]?；ㄉ张c蛋白質復合后會改善蛋白質的功能性質，如表面疏水性、乳化性、起泡性等[13]。因此，更好地了解蛋白質和花色苷的相互作用規律對其在食品體系中的應用至關重要。

蛋白質對花色苷的結合作用可分為共價結合和非共價結合。兩者相互作用可以影響彼此在食物系統的形態、抗氧化能力、熱穩定性、乳化特性和生物利用度。本文綜述了近年來針對花色苷與蛋白質相互作用的研究進展，主要從蛋白質對花色苷穩定性保護和生物利用率的影響、花色苷對蛋白質功能性質的影響及二者復合后的工業應用方面進行闡述，以期為花色苷與蛋白質的互作在食品及其他行業中的應用提供理論參考。

1 花色苷穩定性及蛋白質對花色苷的影響

花色苷的穩定性是目前工業應用急需解決的問題，花色苷可以通過非共價相互作用或共價鍵與蛋白質相互作用，已成為提高其生物活性及消化道穩定性的有效方法。

1.1 花色苷的穩定性

花色苷的穩定性與兩方面因素有關：1）取決于花色苷本身結構。一般來說，花色苷的穩定性與2-苯基苯并吡喃陽離子結構中羥基的數量有關，羥基數量越多穩定性越低，甲基化程度與穩定性呈正相關，游離羥基的糖苷化能夠提高花色苷穩定性[4,14]。附著在花色苷苷元上的糖基單元和酰基以及它們的結合部位，對花色苷分子的穩定性和反應性有重要影響[14]；2）加工和貯藏過程中的理化因素，如pH值、溫度、光、氧、酶、抗壞血酸、糖及其降解產物、二氧化硫、氨基酸、酚酸、金屬離子等[15]?；ㄉ辗€定性、顏色與結構隨pH值變化而變化。研究表明，當pH值低于3.0時，黃烊陽離子是花色苷的主要存在形式，當pH值逐漸升高到6時，花色苷的結構轉化成無色的甲醇假堿和查耳酮假堿，當pH值高于7時，花色苷形成醌類結構[16]?；ㄉ帐軠囟扔绊懽顬轱@著，熱處理會使其化學穩定性、顏色以及功能性發生巨大的變化[17]。溫度達60 ℃以上時，花色苷發生降解轉變為查耳酮[18]。酶對花色苷穩定性影響較大，例如多酚氧化酶和過氧化物酶使植物組織發生酶促褐變，降低花色苷穩定性[19]。研究發現超高壓處理會鈍化部分多酚氧化酶和過氧化物酶，從而起到保護花色苷的作用[20]。另外，光照、抗壞血酸、糖等因素也會使花色苷穩定性降低[21-23]。

1.2 蛋白質與花色苷互作提高花色苷穩定性

表1列出了利用蛋白質作為保護花色苷穩定性載體材料的研究進展。蛋白質對花色苷具有一定的結合能力，但不同的蛋白質對不同的花色苷在親和力方面存在一定的差異性[24-26]。前期的研究發現酪蛋白、乳清分離蛋白、牛血清白蛋白等可通過非共價結合，保護藍莓花色苷在加工貯藏時的穩定性[27-28]，非共價相互作用機制如圖2所示。

表1 蛋白質與花色苷相互作用對花色苷穩定性的影響Table 1 Effects of interaction between proteins and anthocyanins on the stability of anthocyanins

圖2 蛋白質和花色苷通過氫鍵、疏水相互作用和離子相互作用的非共價結合示意圖Fig.2 Schematic diagram of the non-covalent interaction between proteins and anthocyanins through hydrogen bonds,hydrophobic interaction and ionic interaction

1.2.1 天然蛋白質

蛋白質與花色苷在食品加工體系中常常共存。蛋白質與花色苷的結合主要由氨基酸側鏈與花色苷通過氫鍵、疏水相互作用等弱作用力形成。采用多譜法及分子對接等研究手段可有效判斷二者相互作用力類型。Chamizo-González等[29]通過分子對接和分子動力學模擬，評價了葡萄籽7S球蛋白與葡萄錦葵色素-3-葡萄糖苷的相互作用，結果表明7S球蛋白通過氫、烷基和π-烷基鍵與花色苷相互作用，黃烊陽離子朝向蛋白質的疏水區域，保護其免受水化作用。牛奶蛋白與花色苷的結合具有重要的意義，酪蛋白約占牛奶蛋白的80%左右，其中β-酪蛋白可作為矢車菊素-3-葡萄糖苷最具潛力的蛋白載體，這是因為β-酪蛋白與花色苷之間具有更多的氫鍵數量和相互作用能，可以有效提高花色苷穩定性和生物利用度[37]。Gong Shengxiang等[30]發現，紫馬鈴薯花色苷能夠通過靜態猝滅有效地猝滅酪蛋白和乳清分離蛋白的固有熒光，且酪蛋白對花色苷的結合親和力強于乳清分離蛋白，結構分析結果表明，花色苷通過氫鍵和范德華力結合酪蛋白和乳清分離蛋白，分子對接分析結果表明，酪蛋白和乳清分離蛋白與花色苷有不同的結合位點。Meng Yueyue等[31]的熒光光譜分析結果表明，花色苷與蛋白的結合基本上是由非共價相互作用驅動的，結合熱力學結果表明，矢車菊素-3-葡萄糖苷與β-乳球蛋白的結合是自發的，而疏水相互作用在絡合過程中起著至關重要的作用。綜上所述，花色苷穩定性提高的原因可能是，蛋白質與花色苷之間形成了“手-手套”的結合模式，將花色苷包裹在蛋白質特有的空間保護腔中。例如，圖3中不同顏色的區域表示蛋白質與花色苷可能存在幾個結合的口袋，在理論上可以通過分子動力學進一步計算口袋結構域與花色苷的空間匹配程度，篩選出花色苷可能作用口袋，為大分子組分（蛋白質）篩選提供重要的基礎依據。

圖3 蛋白質（α-酪蛋白）與花色苷（錦葵色素-3-半乳糖苷）“手-手套”結合Fig.3 “Hand-glove” binding of protein (α-casein) and anthocyanin(malvidin-3-galactoside)

1.2.2 改性蛋白質

相比于天然蛋白質，改性后的蛋白質對花色苷穩定性有不同的作用效果。有研究發現，在不同pH值條件下，乳清蛋白通過美拉德反應生成的產物有效提高了矢車菊素-3-葡萄糖苷的熱穩定性[38]。Chen Zhongqin等[15]發現預熱后的大豆蛋白分離物結合親和力增強，可以與矢車菊素-3-葡萄糖苷相互作用，有效保護其穩定性。預熱乳清分離蛋白與花色苷相互作用后也發現了類似的現象，這主要歸因于預熱后的蛋白質空間結構得到舒展，與花色苷的作用力增強[39-40]。Ren Shuai等[32]發現在抗壞血酸存在的情況下，添加天然乳清蛋白（質量濃度10 mg/mL）使紫色玉米和葡萄的花色苷半衰期延長約2 倍，黑胡蘿卜花色苷溶液延長約1.31 倍，天然乳清蛋白的加入可有效提高抗壞血酸飲料中花色苷的穩定性，然而預熱乳清蛋白卻對花色苷的半衰期無顯著影響。究其原因可能是天然乳清蛋白加熱到40 ℃或50 ℃時，乳清蛋白折疊結構并沒有打開太多，冷卻后分子的展開可能是可逆的，這可能導致更多的花色苷與抗壞血酸相互作用，使顏色損失增加。

1.3 蛋白質提高花色苷生物利用率

花色苷的生物利用率低是限制其應用的一大難題[41]。在人體消化環境中，口腔pH值為5.6～7.9，胃部pH值為1.5～3.5，腸道pH值為6.7～7.4。由于消化時間短暫，花色苷穩定性在口腔中變化不明顯，在胃部酸性環境下，花色苷主要以紅色黃烊陽離子形式存在，其相對穩定[42]，在小腸中由于消化酶的存在使花色苷發生嚴重降解，黃烊陽離子發生去質子化，僅有少量花色苷到達結腸發揮功效[43]。因此，阻止有色結構到無色結構的轉換是保持花色苷穩定性的關鍵因素[44-45]（圖4）。

圖4 花色苷在消化過程中的結構變化Fig.4 Structural changes of anthocyanins during digestion

蛋白質可以保護花色苷在攝入和同化過程中免受酶促降解和氧化降解[46]?；ㄉ?蛋白質復合物可保護花色苷在胃內不被降解，控制花色苷在腸道內的釋放，增加腸道和結腸內花色苷的含量。目前體外模擬消化是測定花色苷生物利用率最簡單的方式，可以探究消化和吸收過程的每個步驟對花色苷生物利用率的影響[45]。另外，體內研究表明，花色苷在模擬腸道環境中易降解為較小的酚類物質（如原兒茶酸和阿魏酸）。蛋白質可抑制花色苷生物利用率的損失，在消化過程中利用其特有的保護腔，將花色苷包裹在其中，免于消化液及環境改變帶來的破壞[46]。

本團隊前期研究表明，酪蛋白、乳清分離蛋白及牛血清白蛋白在體外模擬消化時對花色苷的穩定性有一定的保護作用[22,46]。通過藥代動力學結果對花色苷在體內的生物利用率加以驗證，發現α-酪蛋白能夠使更多的花色苷以原型的形式被血液吸收[46]。有研究利用體外消化模擬系統（TNO胃腸模型），進一步證明藍莓花色苷-大豆蛋白顆粒相比于藍莓汁，能夠輸送更多的花色苷到達結腸，提高生物利用度[47]。蛋白質-花色苷顆粒通過上胃腸道的過程中保護藍莓花色苷，以便隨后吸收和/或結腸輸送/代謝。花色苷在消化過程中很容易從蛋白質-花色苷顆粒分離，用于隨后的腸道吸收[47]。綜上所述，蛋白質的保護腔包裹花色苷可有效抑制花色苷在消化道環境中降解。

2 花色苷與蛋白質相互作用對蛋白質的影響

蛋白質結合花色苷不僅對花色苷穩定性產生影響，而且會影響蛋白質各級結構的變化[24]。目前關于花色苷對蛋白質影響作用已有報道，實際生產加工中二者易發生相互作用，進而影響蛋白質的功能及營養特性[48-49]。花色苷對蛋白質功能性的影響如表2所示。

表2 花色苷與蛋白質相互作用對蛋白質的影響Table 2 Effects of interaction between anthocyanins and proteins on proteins

2.1 對蛋白質結構的影響

花色苷與蛋白質結合后會影響蛋白質結構變化。蛋白質的氨基酸殘基中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，可以在一定的激發波長下產生固有熒光，稱為蛋白質固有熒光團，它們對微環境極性高度敏感，并已被廣泛用于監測蛋白質結構變化[53-54]。特別是色氨酸熒光研究通常是為了獲得蛋白質色氨酸殘基附近構象變化的信息。熒光光譜研究發現隨著矢車菊素-3-葡萄糖苷的不斷加入，乳清分離蛋白和β-乳球蛋白的熒光強度明顯下降，且光譜最大波長發生輕微變化，說明矢車菊素-3-葡萄糖苷可以改變乳清蛋白色氨酸殘基周圍環境的極性，導致其熒光猝滅[32]。前人研究表明紫馬鈴薯花色苷與酪蛋白和乳清蛋白相互作用后，改變了酪蛋白和乳清蛋白的構象結構，α-螺旋含量和β-轉角含量降低，β-折疊含量和無規卷曲含量增加[31]。除非共價相互作用外，花色苷可以通過酶促（如由多酚氧化酶催化）或自氧化（如在堿性環境中或在氧化劑存在下）產生親電鄰醌，與其他鄰醌進行各種連續的縮合反應，進而與蛋白質共價結合[12]。醌通過酚環與蛋白質的巰基和氨基形成共價鍵（C-N或C-S），且為不可逆反應。Sui Xiaonan等[48]發現花色苷與大豆分離蛋白的共價結合改變了大豆分離蛋白的二級結構，降低了α-螺旋含量和β-折疊含量，由于多肽鏈的展開，大豆分離蛋白的三級結構也受到花色苷摻入的影響。由于蛋白質本身結構復雜，構象變化研究主要局限于二級結構，目前關于花色苷對蛋白質三級、四級結構影響的研究相對較少。

2.2 對蛋白質溶解性的影響

蛋白質的溶解度是其在許多食品和飲料中應用的先決條件，也可能反過來影響其他功能性質，如乳化和發泡特性。影響蛋白質溶解性的內在因素有氨基酸組成、氨基酸序列，外在因素有pH值、溫度、離子強度等[12]?；ㄉ张c蛋白質的結合可以促進蛋白質的交聯，改變蛋白質分子的凈電荷，進而影響蛋白質的溶解度。本團隊前期研究發現，乳清分離蛋白及牛血清白蛋白分別與藍莓花色苷非共價復合后的溶解性相比于單獨的蛋白質樣品有所提高[22]。這可能是蛋白質結構中的疏水基團暴露后，表面疏水性降低導致溶解度增加，還有可能是花色苷結構中引入酚類羥基從而提高了蛋白質的溶解度[22]。

2.3 對蛋白質起泡性和乳化性的影響

花色苷會影響蛋白質-花色苷復合物的起泡性質和乳化性質。Sui Xiaonan等[17]發現與非共價結合相比，大豆分離蛋白與富含矢車菊素-3-葡萄糖苷的黑米提取物共價相互作用的乳化和起泡性增強，這歸因于蛋白質結構的部分去折疊?；ㄉ崭淖兞舜蠖狗蛛x蛋白的二級結構，β-折疊含量減少，β-轉角含量和無規卷曲含量增加，乳化和發泡性能得到改善[52]。結合后乳化和起泡性能的改進部分歸因于在油滴或氣泡周圍形成的界面層的彈性增加，蛋白質和花色苷的復合物形成的界面層可以防止氣泡坍塌或聚結。起泡和乳化能力的增加也可能歸因于復合后蛋白質溶解度的增加，因為蛋白質溶解度增加會促進蛋白質向界面層的快速轉移[54]。

2.4 對蛋白質消化性的影響

前人研究發現花色苷的存在會誘導蛋白質的結構部分去折疊，因此，增加了敏感肽鍵的可及性；通過使用模擬胃腸道消化和Caco-2細胞單層作為跨上皮模型，大豆分離蛋白與富含矢車菊素-3-半乳糖苷的提取物共價結合提高了大豆分離蛋白的胃腸消化特性，但降低了消化樣品中肽的通透性[54]?？偠灾鞍踪|與花色苷的相互作用對蛋白質的吸收產生影響，與二者的種類高度相關[52]。

3 花色苷與蛋白質相互作用的應用

花色苷具有抗氧化、抗癌、抗炎、保護視力、減肥等功效（圖5），使得花色苷的高值化應用備受關注，花色苷制品也深受大眾青睞[30,55]。隨著消費者對營養健康的膳食需求日益增強，為了滿足消費者對綠色添加劑的需求，將食物中存在的天然成分與花色苷相互作用以提高花色苷的穩定性是一種受歡迎的方式。花色苷在漿果、蔬菜、薯類和谷物種皮中的含量尤為豐富，保護花色苷的穩定性有助于提升其應用價值，通過花色苷與蛋白質的相互作用可一定程度上實現對花色苷的保護。

圖5 蛋白質-花色苷功能產品的應用及功能Fig.5 Applications and functions of protein-anthocyanin functional products

3.1 花色苷-蛋白質復合物在液態體系中的應用

隨著人們對食品營養的關注度越來越高，市面上各式新型保健飲料層出不窮。在功能性飲料體系中，常會添加蔗糖和VC等添加劑，易使花色苷穩定性降低，而添加一定量的蛋白質后，果汁的營養價值不僅提高，還能保護花色苷的穩定性[40]。Ren Shuai等[32]發現在抗壞血酸存在時很快降低了花色苷的化學穩定性和顏色穩定性，并縮短半衰期，而乳清分離蛋白的加入，使花色苷在飲料體系中的穩定性顯著增加。本團隊前期研究發現，在果奶體系中，牛奶蛋白與花色苷形成的復合物，可有效提高藍莓花色苷的穩定性，并改善蛋白質的功能性質，為果奶產品的加工提供理論基礎[22]。

3.2 花色苷-蛋白質復合物在固態體系中的應用

對于含有蛋白質的食品，如冰淇淋、面包等，加入花色苷有助于改善此類食品的感官指標，增加營養功能。研究發現大米蛋白是一種與其他植物蛋白相比具有低過敏性、氨基酸組成較高的營養蛋白，適合大多數人食用，當其與花色苷通過氫鍵和疏水相互作用結合后，大米蛋白的抗氧化活性、起泡性等得到改善，使其在嬰兒配方奶粉和烘焙食品等產品中具有非常好的應用前景[33]。蛋白質與花色苷相互作用后不僅會影響二者之間的功能特性，也可以降低某些食物口味的感知強度[55]。上述研究結果為普遍存在的蛋白質-花色苷相互作用如何影響合成產物的質量提供了理論參考，并為設計具有強化生物活性和功能特性的高質量食品提供理論基礎。

4 結語

花色苷具有多種功能性質而深受大眾喜愛，但其易降解、穩定性差。花色苷與蛋白質相互作用是一種安全高效且綠色的方法，這種結合會對花色苷穩定性起到一定的保護作用，且使其生物利用率也得到改善，減少功能基團在加工、貯藏和運輸等過程中的降解，為花色苷穩態化提供了新方法。與此同時，蛋白質與花色苷相互作用還會影響蛋白質各級結構（如α-螺旋、β-折疊、無規卷曲等結構）的變化，從而影響蛋白質的溶解性、起泡性及乳化性等功能特性，賦予食品更高的營養價值。蛋白質與花色苷復合體系對于食品貨架期的延長以及顏色保持都具有積極影響。目前花色苷及蛋白質相關產品的加工應用范圍已逐步擴大，可為食品的深加工及利用提供研究基礎。雖然花色苷和蛋白質之間的相互作用已經被廣泛研究，但仍有許多方面有待進一步闡明。首先，花色苷和蛋白質之間的作用力取決于花色苷及蛋白質的化學結構，不同的花色苷與蛋白質之間存在不同的結合力，需要逐一探討；其次，在食品加工中，如何最大化地保持花色苷的穩定性及蛋白質的功能特性仍是一項艱巨的任務，未來仍需著力發展產品高值化的新技術，以期實現體內的高效及精準遞送。