不同溫度對超高壓處理鮮榨生菜汁貯藏穩定性的影響

李芝萱，鈔春明，張佳龍，李玉玲，唐選明，潘艷芳,*

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，農業農村部農產品加工重點實驗室，北京 100193；2.東海縣飄順科技有限公司，江蘇 東海 222300；3.江蘇省東海農業發展集團有限公司，江蘇 東海 222300）

蔬菜是人類獲取礦物質的主要來源，且其維生素和膳食纖維含量豐富，具有調節酸堿平衡、提高免疫力和抗氧化能力、潤腸通便等功能[1-3]。新鮮蔬菜水分含量高、蒸騰作用強，易出現失水萎蔫、黃化、衰老、腐爛變質等現象[4]。通過機械物理等技術手段將蔬菜加工成蔬菜汁、蔬菜脆片或蔬菜粉等產品，不僅可以有效解決蔬菜產量過剩的問題，豐富市場中蔬菜制品種類，更能夠提高蔬菜附加值[5]。

相較于其他加工制品，果蔬汁可最大程度保留果蔬中的營養和活性成分。基于消費者對天然風味和營養健康需求的不斷增長，鮮榨果蔬汁可以作為即食新鮮果蔬資源的替代品[6]。區別于現有市場上鮮榨水果汁或果蔬汁的高糖高熱量，鮮榨蔬菜汁具有低糖、低脂、高膳食纖維等顯著獨特優勢，有望成為市場的流行趨勢[7]。葉用萵苣（Lactuca sativaL.）俗稱生菜，其組織脆嫩、色澤鮮綠、口感清香，維生素和礦物質營養全面[8-9]，鮮榨生菜汁（fresh lettuce juice，FLJ）加工適宜性強、原料利用率高，能夠填補綠色果蔬汁的市場空白。

FLJ貯藏穩定性的影響因素主要包括加工工藝和貯藏溫度[10]。殺菌是FLJ加工的必要和關鍵環節。與熱殺菌會破壞活性成分，影響產品色澤、風味和口感相比，超高壓（ultra-high pressure，UHP）利用100～1000 MPa壓力在短時間內殺滅微生物或病原體，可最大程度地保留FLJ原有的風味和營養價值[11-14]。冷藏（0～10 ℃）是非濃縮還原果蔬汁的必要貯藏條件[15]，不同貨架、冰箱和冷柜的冷藏溫度對FLJ葉綠素降解和體系沉降等貨架期穩定性影響較大。當前市場缺乏以綠色葉菜為來源的鮮榨蔬菜汁，且不同冷藏溫度UHP處理對FLJ貯藏穩定性影響的研究鮮見報道。

本研究以綠蘿莎生菜為原料，采用UHP殺菌工藝制備FLJ，進一步探究UHP處理后FLJ在0、4、8 ℃ 3 種冷藏溫度下貯藏期間微生物指標、理化指標、色澤、物性等的變化，闡釋不同溫度對UHP處理FLJ貯藏穩定性的影響，為豐富鮮榨蔬菜汁市場品類、確定不同溫度FLJ貨架期提供技術參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠蘿莎水培生菜購自北京創世大業科技有限公司，選取生長周期（25f 1）d、質量為（120f 5）g的生菜，當天采摘并于2 h內運回實驗室。

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA） 北京奧博星生物技術有限公司；無水乙醇、丙酮 國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白標準品、考馬斯亮藍G-250北京索萊寶科技有限公司；植物可溶性糖、總酚含量測定試劑盒 蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Spark型多功能酶標儀 上海帝肯貿易有限公司；DigiEye型電子眼 英國Verivide公司；Physica MCR 301型流變儀 奧地利Anton Paar有限公司；S3500型激光粒度分析儀 美國麥奇克儀器有限公司；Turbiscan tower型穩定性分析儀 北京朗迪森科技有限公司；2h 300 L型600 MPa超高壓殺菌機 包頭科發高壓科技有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 FLJ的制備

選取無機械損傷的新鮮綠蘿莎水培生菜，去根、清洗、瀝干水分、切段、打漿、過膠體磨、靜置。將靜置后的生菜汁用100 目篩絹過濾，罐裝于100 mL棕色瓶中UHP殺菌，在25 ℃下600 MPa保壓120 s，即得FLJ。制品于0、4、8 ℃條件下貯藏30 d，每5 d定期取樣測定相關指標。

1.3.2 微生物指標測定

按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[16]和GB 4789.15-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母菌計數》[17]第一法分別測定總好氧菌（total aerobic bacteria，TAB）以及霉菌和酵母菌（yeasts and molds，Y&M）數量。

1.3.3 理化指標測定

采用手持式糖酸度儀檢測總可溶性固形物（total soluble solids，TSS）含量。采用pH計測定pH值。

1.3.4 葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量測定

參照Zhao Liang等[18]和El-Nakhel等[19]的方法測定葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量，加入體積分數95%的乙醇溶液提取葉綠素，浸提液于25 ℃避光提取5 h，12000hg離心15 min取上清液檢測。

1.3.5 色澤測定

參考文獻[20-21]采用電子眼測定FLJ樣品的L*值（亮度）、a*值（紅綠度）、b*值（黃藍度）、C*值（飽和度）和h（色調角）。

1.3.6 固形物質量分數和體積測定

參照Bai Jinhe等[22]的方法測定固形物（pellets and insoluble solids，P&ISS）質量分數。參照Sun Xiuxiu等[23]的方法測定固形物體積（pellet volume，PV）占比。

1.3.7 混濁度測定

參照Kubo等[24]的方法測定渾濁度。

1.3.8 粒徑分布測定

參考文獻[25-26]采用S3500系列型激光粒度分析儀測定粒徑分布。

1.3.9 表觀黏度測定

參考文獻[27]采用Physica MCR 301型流變儀測定表觀黏度，通過Start Rheoplus軟件記錄流變數據。

1.3.10 渾濁穩定性測定

參考Dahdouh等[27]的方法利用多重光光散射理論測定渾濁穩定性。采用Turbiscan Tower型穩定性分析儀，光源波長為脈沖式近紅外光源（880 nm），準確吸取20 mL樣品于平底玻璃瓶中（外徑27.5 mm、高度70 mm），上機檢測，儀器設置溫度為4 ℃，上機檢測時間為8 h。參考文獻[28]利用Towersoft-1.2.0.64-2軟件計算樣品的穩定性指數（turbiscan stability index，TSI）。

1.4 數據處理與分析

所有實驗進行3～6 次重復。采用OriginPro 9.0軟件進行數據處理與繪圖。采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，組間數據采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 FLJ中微生物的變化

微生物是影響果蔬汁產品安全性的關鍵因素，產品進行UHP處理后和貯藏過程中微生物不得超過GB 7101-2015《食品安全國家標準 飲料》[29]限量標準。未處理前FLJ的TAB數量為（12750f 30.82）CFU/mL，Y&M數量為（15050f 34.79）CFU/mL。如圖1所示，UHP處理后FLJ的TAB和Y&M數量明顯降低，分別為（26.00f 9.53）CFU/mL和（2.00f 1.00）CFU/mL，表明UHP 處理可使FLJ 的TAB、Y&M 水平低于GB 7101-2015限量標準。有研究表明，經UHP處理后菠蘿汁的Y&M完全失活，且TAB數量降低[13]，Stinco[12]和Xu Xinxing[30]等也得出了類似的結論。0、4、8 ℃貯藏30 d后TAB總數分別為（37.33f 8.08）、（51.66f 6.65）、（84.66f 11.71）CFU/mL，Y&M數量分別為（2.33 f 0.57）、（4.00 f 1.00）、（7.67f 1.52）CFU/mL，均未超過GB 7101-2015限量標準。因此，在0、4、8 ℃條件下，貯藏30 d期間FLJ不存在微生物安全問題。微生物水平的增加可能與存活細胞的繁殖和損傷細胞的恢復有關，因為物理處理（高壓、熱、輻射等）和化學處理后的孢子很可能仍以高抗性休眠形式存在，并且其抗性隨著營養豐富程度增加而增強，因此一些微生物能夠通過自我修復方式來恢復生長[31]。

圖1 不同貯藏溫度下FLJ的TAB（A）和Y&M（B）數量隨貯藏時間的變化Fig.1 Changes in total aerobic bacterial count (A) and total count of yeasts and molds (B) in FLJ as a function of storage time under different temperatures

2.2 FLJ理化性質和葉綠素的變化

2.2.1 理化性質

果蔬汁中的TSS 由游離或組合形式的還原糖和非還原糖組成，是影響消費者對果蔬汁可接受度的主要因素之一[14]。UHP處理后FLJ的TSS含量為（2.57f 0.06）°Brix，如圖2A所示，0、4、8 ℃貯藏30 d后FLJ的TSS含量分別為（3.23f 0.21）、（3.60f 0.35）、（3.73f 0.29）°Brix，三者差異不明顯。如圖2B所示，UHP處理后FLJ的pH值為5.40f 0.06，0 ℃貯藏30 d期間pH值升至5.87f 0.26，而4 ℃和8 ℃貯藏30 d時pH值分別下降至4.66f 0.08和4.37f 0.08。Inanoglu[32]和Wang Rongrong[33]等分別采用UHP處理青豆和黃瓜汁并貯藏，結果發現其pH值顯著降低。微生物的生長可能是造成pH值下降的原因[32,34]，說明溫度越低越有利于抑制微生物生長、延緩pH值的下降，提升FLJ葉綠素的貯藏穩定性。

圖2 不同貯藏溫度下FLJ的TSS含量（A）和pH值（B）隨時間的變化Fig.2 Changes in TSS content (A) and pH (B) of FLJ as a function of storage time under different temperatures

2.2.2 葉綠素

葉綠素是綠葉菜中分布最豐富的天然植物色素，并且主要以葉綠素a和葉綠素b的形式存在，分別呈現出典型的藍綠色或黃綠色[35]。UHP處理后FLJ的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量分別為（48.18f 1.80）、（20.75f 0.86）、（68.94f 2.65）μg/100 g。

如圖3A所示，隨著貯藏時間的延長，0 ℃下FLJ中葉綠素a含量呈平緩的下降趨勢，而4 ℃和8 ℃下FLJ葉綠素a含量明顯降低。0、4、8 ℃貯藏30 d后葉綠素a含量分別下降了23.93%、59.67%、74.92%。如圖3B所示，0、4、8 ℃貯藏30 d后FLJ中葉綠素b含量分別下降了7.37%、17.01%、48.82%。葉綠素b高壓處理后的穩定性高于葉綠素a，這與van Loey等[36]的研究結果一致。如圖3C所示，0、4、8 ℃貯藏30 d后，FLJ的總葉綠素含量分別下降了18.96%、46.84%、67.07%，Xu Xinxing[30]和Inanoglu[32]等也證實了貯藏溫度對葉綠素的降解有顯著影響，其中，Inanoglu等發現UHP處理的青豆在10 ℃下貯藏與在2 ℃下貯藏相比葉綠素降解速率更快；Xu Xinxing等的研究表明高靜壓處理獼猴桃汁的葉綠素含量在25 ℃下貯藏期間比4 ℃下貯藏期間下降得更快。另有研究表明，熱、光、氧和pH值都是誘導葉綠素降解的因素[33]。Schwartz等[37]認為，蔬菜中葉綠素的降解是葉綠素降解為脫鎂葉綠素進而降解為焦脫鎂葉綠酸的結果。此外，微生物滋生產生的酸能夠加速果蔬的顏色變化，pH值降低有利于H＋取代Mg2＋，進而加速葉綠素轉化為脫鎂葉綠素[38]。

圖3 不同貯藏溫度下FLJ的葉綠素a（A）、葉綠素b（B）和總葉綠素（C）含量隨時間的變化Fig.3 Changes in lorophyll a (A),chlorophyll b (B),and total chlorophyll (C) contents of FLJ as a function of storage time under different temperatures

2.3 FLJ色澤的變化

色澤直接關系著消費者對FLJ的購買欲及其市場價值。如表1所示，UHP處理后的FLJ色澤參數中，隨著貯藏時間的延長，4 ℃和8 ℃貯藏條件下a*、b*和C*值總體呈上升趨勢，h總體呈下降趨勢；0 ℃貯藏條件下L*值總體下降，4 ℃和8 ℃貯藏條件下L*值總體升高。這一規律也在濁富硒獼猴桃汁中被報道[30]。

表1 不同貯藏溫度下FLJ的色澤隨貯藏時間的變化Table 1 Changes in color of FLJ as a function of storage time under different temperatures

L*值的變化與渾濁度呈負相關，貯藏期間L*值的上升表明FLJ的亮度增加，說明FLJ的渾濁度下降。a*值是表征綠色葉菜汁最重要的色澤參數，直接影響產品的商品價值，0 ℃貯藏期間FLJ的a*值變化不顯著，4 ℃貯藏15 d和8 ℃貯藏10 d時FLJ的a*值已發生顯著上升（P＜0.05）。有研究者認為a*值的變化與葉綠素含量的變化呈負相關[39-40]，隨著貯藏時間的延長a*值增大，說明綠色減少，紅色增加，這一現象同樣在獼猴桃汁[30]、菠菜泥[33]和青豆[32,38]中被發現。b*和C*值在30 d貯藏期間的變化規律與a*值類似。FLJ的色澤參數變化可能是由諸多因素造成的，例如酶促和非酶促褐變、葉綠素降解、美拉德反應以及多酚的降解或聚合等[41]。

2.4 FLJ物理穩定性的變化

2.4.1 P&ISS質量分數和PV占比

如圖4A所示，UHP處理后FLJ的P&ISS質量分數為（0.78f 0.03）%，在不同溫度貯藏30 d期間FLJ的P&ISS質量分數變化不明顯，表明貯藏溫度對FLJ的P&ISS質量分數沒有明顯影響。如圖4B所示，UHP處理后FLJ的PV占比為（10.47f 0.50）%，0、4、8 ℃貯藏30 d后FLJ的PV占比分別升高至（21.00f 0.50）%、（28.00f 1.50）%、（35.33f 0.76）%。表明貯藏溫度越低越有利于FLJ顆粒體積的穩定性。研究表明胡蘿卜汁在4 ℃貯藏期間的離心沉降率無顯著變化，而25 ℃和37 ℃條件下在貯藏前期出現顯著性差異[42]。PV占比增大主要是隨著貯藏時間的延長顆粒出現聚集、絮凝和果肉纖維膨脹等導致的，同時導致FLJ渾濁度降低，使得上清液中溶解物質的濃度更低，即PV與渾濁度在貯藏過程中呈負相關[27]。

圖4 不同貯藏溫度下FLJ的P&ISS質量分數（A）和PV占比（B）隨貯藏時間的變化Fig.4 Changes in P&ISS cotent (A) and PV of FLJ proportion (B) as a function of storage time under different temperatures

2.4.2 渾濁度

渾濁度被認為是鮮榨果蔬汁最重要的質量評價指標之一[25]。如圖5所示，UHP處理后FLJ的渾濁度為（22.84f 0.05）%，0 ℃貯藏期間FLJ的渾濁度呈平緩趨勢，表明0 ℃貯藏有利于FLJ的懸浮穩定性，而4 ℃和8 ℃貯藏期間FLJ的渾濁度均呈下降趨勢，貯藏30 d后FLJ的渾濁度分別降低至（13.78f 0.62）%和（11.90f 1.12）%，表明貯藏溫度越高FLJ的懸浮穩定性越低。研究發現，芒果汁的懸浮液穩定性隨著貯藏溫度的升高呈現明顯的下降趨勢，其在25 ℃和37 ℃下貯藏時的渾濁度比在4 ℃下貯藏下降得更快[34]；草莓汁的渾濁度隨貯藏時間的延長而降低[43]。生菜汁渾濁度的降低，其中一個原因可能是UHP處理沒有完全鈍化酶的活性，溫度越低越有助于抑制酶的活性，另外一個原因可能是較大果漿顆粒沉淀和酚類化合物以及蛋白質聚合[43]。綜上所述，0 ℃有利于FLJ的貯藏穩定性。

圖5 不同貯藏溫度下FLJ的渾濁度隨貯藏時間的變化Fig.5 Changes in turbidity of FLJ as a function of storage time under different temperatures

2.4.3 粒徑分布

渾濁果蔬汁是一種復雜且由多種不溶性物質組成的不均勻懸浮液[28]，這些物質的顆粒大小及其粒徑分布在貯藏過程中會發生變化，從而影響果蔬汁貯藏穩定性。如圖6所示，UHP處理后FLJ的粒徑呈單峰分布，粒徑集中分布在2～10 μm，隨貯藏時間的延長，2～10 μm的峰面積先增大后減小，且大粒徑的峰數增加；隨著貯藏溫度的升高，2～10 μm的峰面積減小速率加快，表明小粒徑顆粒數量減少，大粒徑顆粒數量增多，FLJ的懸浮穩定性降低。這可能是由于貯藏前期FLJ中較小的纖維在水中膨脹并相互聚集，后期由于微生物數量增加及酶活性升高等促使單個細胞與團簇的分離，形成分散相[28,44]。0 ℃貯藏條件下，FLJ在2～10 μm的峰面積隨貯藏時間延長變化較為平緩，而4 ℃和8 ℃貯藏峰面積隨貯藏時間延長明顯減小，大粒徑的峰數增多。綜上，貯藏溫度會影響果蔬汁的粒徑穩定性，其中0 ℃有利于FLJ的貯藏。

圖6 不同貯藏溫度下FLJ的粒徑分布隨貯藏時間的變化Fig.6 Changes in particle size distribution of FLJ as a function of storage time under different temperatures

2.4.4 表觀黏度

如圖7所示，UHP處理后FLJ的表觀黏度均隨剪切速率的增加而明顯降低，在最低剪切速率時最大，在較高剪切速率時趨于平緩，說明FLJ屬于非牛頓流體[45]。UHP處理后（0 d）在剪切速率為100 s－1時的初始表觀黏度為1.41 mPa?s，在0、4、8 ℃貯藏30 d期間FLJ的表觀黏度隨著貯藏時間的延長和貯藏溫度的升高而增加，0、4 ℃和8 ℃貯藏30 d后FLJ的表觀黏度分別增加了2、2.8 倍和3.1 倍。Szczepańska等[41]研究發現，采用UHP處理后以及在冷藏過程中蘋果汁的黏度增加，一方面是由于高分子碳水化合物（如淀粉和果膠）的溶解度增加；另一方面是由于UHP引起的蛋白-組織凝固或壓實效應。此外，Kahraman等[46]也發現連續流凈化處理后的蘋果-胡蘿卜汁在4 ℃貯藏12 d期間黏度增加，可能是糖分從細胞遷移到果汁促使膠體系統中的濃度增加所致。

圖7 不同貯藏溫度下FLJ的表觀黏度隨貯藏時間的變化Fig.7 Changes in apparent viscosity of FLJ as a function of storage time under different temperatures

2.4.5 FLJ穩定性

背散射光技術（多重散射光技術）可以實現所有目測范圍內樣品的檢測并記錄不穩定性現象[47]。通過分析背散射光圖譜，可實現對不同貯藏溫度和不同貯藏時間下FLJ樣品穩定性的評價。

如圖8所示，UHP處理后FLJ的背散射光圖譜顯示相對穩定，在底部和頂部存在少量的固形物沉淀和上浮現象。但在貯藏過程中，背散射光值受貯藏時間（0、15、30 d）和貯藏溫度（0、4、8 ℃）的影響較大。0 ℃貯藏FLJ隨著貯藏時間的延長底部沉淀量增加緩慢，中部出現少量的凝膠化現象，頂部發生少量上浮和澄清現象；4 ℃貯藏的FLJ隨著貯藏時間的延長底部沉淀量增加較快，中部發生粒徑變化和濃度降低現象，頂部發生明顯的上浮和澄清現象；8 ℃貯藏的FLJ隨著貯藏時間的延長底部沉淀量增加最快，中部發生濃度降低現象，頂部發生更明顯的上浮和澄清現象。貯藏15 d時，隨著貯藏溫度的升高，底部沉淀量增大，中部粒徑發生變化使得濃度降低的程度加快，頂部發生澄清和上浮的程度也增大；貯藏30 d時，隨著貯藏溫度的升高，底部沉淀量進一步增大，中部粒徑發生變化，使得濃度降低的程度進一步加快，頂部發生澄清和上浮的程度也進一步增大。

圖8 不同FLJ樣品在檢測8 h期間的背散射光圖譜Fig.8 Backscattering profiles of different FLJ samples determined for 8 h

TSI為穩定性指數，TSI越小表明果蔬汁穩定性越好。如圖9和圖10所示，上機檢測8 h后，對照組FLJ的TSI為0.59f 0.03，隨著貯藏時間的延長，FLJ的TSI呈上升趨勢；隨著貯藏溫度的升高，FLJ的TSI上升趨勢加快，且0 ℃的FLJ在整個貯藏期間的穩定性最好。因此貯藏溫度越低，越有利于FLJ的貯藏穩定性。貯藏15 d后，從圖9可直觀地看出0 ℃和4 ℃的FLJ穩定性依然較好。貯藏30 d后，0 ℃條件下的FLJ的TSI為7.27f 2.82，但4 ℃和8 ℃條件下FLJ的TSI均超過28，表明樣品極不穩定。影響FLJ穩定性的因素主要為粒徑大小及粒徑分布，且根據Stokes定律可知，顆粒的遷移速度與顆粒的大小呈負相關，即較大的顆粒更容易沉淀，較小的顆粒可在懸浮液中停留的時間更長[28,48]，隨著貯藏溫度的升高和貯藏時間的延長，FLJ的粒徑逐漸增大，穩定性逐漸降低。

圖9 不同FLJ樣品在檢測8 h后的表觀視圖Fig.9 Visual appearance of different FLJ samples after 8 h determination

圖10 不同FLJ樣品在檢測8 h期間的TSIFig.10 TSI of different FLJ samples determined for 8 h

3 結論

本研究從微生物指標、色澤參數、理化指標和物理特性等方面探究了UHP（600 MPa、2 min）處理FLJ在不同溫度（0、4、8 ℃）下貯藏30 d的貯藏穩定性。結果表明，不同溫度UHP處理FLJ在整個貯藏期內TAB和Y&M水平均低于國家標準限量。FLJ在0 ℃貯藏30 d內可以較好地保留原有色澤，而4 ℃和8 ℃分別貯藏15 d和10 d時色澤發生明顯變化，呈現棕褐色。同時，FLJ的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量均隨貯藏時間的延長而降低，且0 ℃的下降速率較4 ℃和8 ℃的下降速率慢。此外，在貯藏過程中FLJ的TSS含量和P&ISS質量分數無明顯變化，而4 ℃和8 ℃下pH值隨著貯藏溫度升高而降低。最后，0 ℃貯藏30 d期間FLJ的粒徑分布、表觀黏度和TSI等穩定性參數變化較小，但是隨著貯藏溫度升高其各項參數變化速率加快。綜上所述，0 ℃在保持FLJ色澤、葉綠素、理化和物性指標等方面具有顯著優勢，可作為FLJ的最佳貯藏溫度。本研究豐富了鮮榨蔬菜汁市場品類，可為鮮榨蔬菜汁加工和貯藏提供技術參考。