阿魏酸鈉經RhoA和Rho-kinase信號通路抑制小鼠肝纖維化的機制研究*

趙蔚林 李 君

湘潭醫衛職業技術學院，湖南省湘潭市 411102

肝纖維化(Hepatic fibrosis)是肝臟受到損傷后，產生的一種持續存在狀態。其是肝臟組織開始修復時，如果細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)的合成與降解平衡狀態發生失衡，從而導致肝臟出現的一系列病理學改變[1-2]。當機體發生肝纖維化時，如不及早進行干預治療，將發展為肝硬化，甚至肝癌?，F階段肝硬化、肝癌是我們國家常見病、多發病及重要的死亡原因，其病理主要特征為肝組織呈現彌漫性纖維化、假小葉及再生結節形成[3]。

據目前研究發現肝纖維化的典型特征為肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)活化和ECM沉積[4]，分子機制涉及到炎癥因子、生長因子、趨化因子和氧化應激相關分子等，因此，深入研究肝臟纖維化的發病機制，并由此基礎上探索新的治療靶點，在減少肝硬化和肝癌的發生尤為重要。

阿魏酸鈉(化學名稱：3-甲氧基-4-羥基桂皮酸鈉鹽二水合物)系阿魏、川芎、當歸等中藥提取物中的單體活性成分經化學修飾所得?，F代藥理學研究表明，其具有抗氧化、抗凝、抗炎、改善血液流變學等功效，現臨床上廣泛運用于心血管系統疾病的治療[5]。但據最新研究報道，發現阿魏酸鈉具有抑制肝纖維化的功效，但具體作用機制現階段尚不明確[6]。本研究將以信號通道為切入點，構建以CCl4-花生油誘導肝纖維化模型，通過阿魏酸鈉治療的肝纖維化小鼠為研究對象，探討阿魏酸鈉抑制肝纖維化的分子作用機制，從而為臨床治療肝纖維化提供一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：雄性CL小鼠60只，體質量160～210g(中南大學湘雅醫學院)，實驗動物編號：SYXK(湘)2015-0014。飼養條件：溫度25℃，濕度(55±10)%，給予標準的食物和水。(2)主要試劑及儀器：阿魏酸鈉(成都嘉葉生物科技有限公司，純度：98%)。CCl4購于江蘇清泉化學股份有限公司(批號20210901)；花生油購于青島吳昊植物油有限公司。透明質酸(HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)和Ⅳ型膠原(CⅣ)試劑盒，BCA蛋白濃度測定、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑試劑盒均購自上海透景生命科技股份有限公司；兔多克隆RhoA抗體、小鼠單克隆α-SMA 抗體購于湖南純清生物科技有限公司。兔多克隆eNOS 抗體、ROCK抗體購自廣東椰泰生物科技有限公司。DAB試劑盒購于山東濱州智源生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠肝纖維化模型建立：適應性飼養1周后，將小鼠依據隨機數字表法分成正常對照組、模型組、給藥組，每組20只。模型組和對照組小鼠均灌胃給予 CCl4-花生油(1∶1，V/V)1ml/kg灌胃，1次/d，連續8周。從第9周開始，給藥組各小鼠給予阿魏酸鈉20mg/kg灌胃，1次/d，連續給藥4周。

1.2.2 小鼠肝臟標本制作：12周后，將小鼠分別稱重，并按照50mg/kg劑量戊巴比妥鈉，分別進行麻醉，于腹主動脈處取血，并分離，留取血清；同時制作各組肝臟組織標本，逐個稱肝重并記錄，然后用剪刀在各小鼠的肝臟相同部位剪取組織標本，置于福爾馬林溶液中固定，剩余肝組織迅速置于-80℃冰箱中冰凍并留存[7]。

1.2.3 肝組織影像學檢測：對實驗小鼠最后一次給予阿魏酸鈉灌胃后，當即隨機從各組中抽取5只小鼠，分別對其進行肝臟超聲檢測。對被檢測小鼠，予以禁食、不禁水8h，并按照體重，腹腔內分別注射戊巴比妥鈉(給藥劑量：50mg/kg)，以麻醉小鼠，完善小鼠肝區體毛剃除，充分暴露肝臟體表投影區域，將其仰臥位固定于試驗平板，采用飛利浦Affiniti 70彩色多普勒超聲診斷儀，并采用其配備彈性成像定量軟件包及eL18-4鉑凈線陣探頭(頻率：4～18MHz)。掃描小鼠肝臟，檢測肝臟大小、形態、軟硬度等指標，得到二維均值。

1.2.4 肝功能及肝纖維化指標檢測：采集各組試驗小鼠血清，運用全自動生化儀，對血清中天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase， AST)、谷氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransfease，ALT)的表達情況進行檢測[8]。運用全自動化學發光免疫檢測儀，分別對小鼠血清標本中肝纖維化指標：透明質酸(HA)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、Ⅲ型前膠原肽(PⅢP)和層黏蛋白(LN)的含量進行檢測，并分別記錄[3]。

1.2.5 肝臟組織病理學檢測：分別對各試驗組小鼠的肝臟組織，采用4%多聚甲醛溶液進行固定48h以上，并常規使用石蠟包埋，制作成5μm厚度的組織切片，對其分別予以HE和Masson三色染色，在光學顯微鏡下觀察各試驗組小鼠肝臟組織的病理染色情況[3]。并嚴格按照2000年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會一起聯合制定的《病毒性肝炎防治方案》中，對肝臟組織結構破壞類型、范圍及程度，將對肝微循環影響的大小將肝纖維化劃分為1～4期(S1～4)[9]，見表1 。對各小鼠肝組織切片，在顯微鏡下拍照，并按照分組及病理變化分類。

表1 肝纖維化分期

1.2.6 肝組織免疫組化檢測：將各組小鼠肝組織切片置放玻片上，使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ中10min浸泡，使其充分脫蠟；各組織乙醇浸泡6min，然后流水15min浸洗，再將載玻片置于PBS玻片缸，搖床上晃動并洗滌6min×3次；在室溫、嚴格避光的環境下，予3% H2O2以20min孵育，再PBS洗滌6min×3次；滴加入5%BSA溶液，并采用室溫條件下封閉30min，傾除多余溶液。

1.2.6.1 肝臟組織中RhoA呈現情況：對兔來源抗RhoA，使用PBS對其1∶300比例進行充分稀釋，滴50～100μl至切片，在10℃冰箱中孵育12h；取出后室溫下靜置2h，PBS反復洗滌10min×4次，再切片放至蘇木素染液中，染色15s后，使用流水浸洗10min，用普通顯微鏡觀察細胞核著藍色，予以二甲苯Ⅰ、Ⅱ分別再浸泡處理20min；制作好的切片置于通風櫥中，充分通風20min，使其晾干，滴加中性樹膠，并采用玻片覆蓋，再次晾干；使用電子顯微鏡觀察各組小鼠肝臟組織病理結構改變，逐個攝片及保存。

1.2.6.2 肝臟組織中Rho-kinase的表達：小鼠肝組織滴加山羊血清封閉液，放置于濕盒中，在室溫條件下孵育15min。在切片上滴加RhoA，Rho-kinase抗體4℃冰箱條件下過夜；再室溫情況靜置3h，PBS反復洗滌各組切片10min×4次。分組滴加生物素標記二抗工作液，室溫下孵育20min，PBS充分洗滌15min×3次；洗滌后采用DAB顯色，并蘇木素染核，染色成果后逐一封片。

1.2.6.3 RhoA，Rho-kinase陽性表現情況：肝細胞細胞質中出現棕褐色或棕黃色顆粒。光學高倍鏡下，每張切片上隨機至少抽取8個完整并相互不重疊視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測定每個視野下陽性反應的IOD值，統計分析使用SPSS22.0軟件。

2 結果

2.1 小鼠狀態 建模8周后，正常對照組的小鼠進食正常，對外界刺激反應靈敏；肝臟外觀色澤飽滿，邊緣銳利，表面光滑，呈現正常肝臟形態。模型組、給藥組小鼠均對外界刺激反應遲鈍，欠活潑，進食量明顯減少。建模期間，模型組、給藥組分別死亡2只。

2.2 肝組織影像學檢測

2.2.1 二維超聲模式：采用二維超聲模式分別對各組小鼠肝臟的形態結構、回聲改變等進行逐一檢測，結果見圖1。結果提示，正常對照組小鼠肝臟表面光滑，肝實質回聲均勻，彌漫性細顆粒狀，肝內膽管系統結構清晰。而模型組小鼠肝臟表面欠光滑，呈現出小結節樣改變，肝內回聲增粗、變強，肝內膽管系統結構混亂，難以鑒別。而經過阿魏酸鈉干預后，給藥組小鼠肝臟表面見光滑，肝臟組織實質回聲改變均較模型組有明顯減輕。

正常對照組 模型組 給藥組

2.2.2 超聲彈性成像模式：在超聲彈性成像技術下，各試驗組小鼠肝臟組織超聲彈性成像技術下改變情況見圖2。正常對照組小鼠肝臟主要為綠色，少部分呈現藍色，其中紅色部分系肝葉組織間隙和肝內管道結構。模型組小鼠肝臟中主要呈現大量藍色，綠色和紅色占比少，而經阿魏酸鈉干預后的給藥組，其藍色比模型組顯著減少，趨近正常對照組影像。

正常對照組 模型組 給藥組

2.3 肝臟硬度值 與正常對照組和給藥組比較，模型組小鼠肝臟的硬度值均明顯增強。對比試驗結果，得出經阿魏酸鈉干預后，小鼠肝纖維化程度可有明顯減輕。結果見表2。

表2 各組小鼠肝臟硬度值對比

2.4 肝功能檢測和肝纖維化指標 模型組小鼠肝功能指標(AST、ALT)對比正常對照組明顯升高(P<0.05)；阿魏酸鈉給藥后可見降低(P<0.05)。模型組小鼠4項肝纖維化指標對比正常對照組(PⅢP、HA、CⅣ和LN)有顯著升高(P<0.05)。結果見表3。

表3 各組小鼠肝功能和肝纖維化指標

2.5 肝臟組織病理學染色 小鼠肝臟組織HE染色和Masson三色染色結果表明，正常對照組肝臟組織結構有序正常，肝小葉結構清晰，沒有出現纖維結締組織增生和脂肪變性、壞死現象，是正常肝臟病理形態。模型組發現小鼠肝臟組織中出現大量肝細胞壞死現象，肝匯管區、肝小葉及肝竇結構表現出嚴重紊亂，可見顯著纖維結締組織增生，并可見膠原物質沉積。給藥組肝纖維化明顯有改善，膠原物質沉積較模型組明顯減輕。結果見圖3、圖4。

正常對照組 模型組 給藥組

2.6 小鼠肝臟組織內RhoA、Rho-kinase的含量 模型組小鼠肝臟組織內RhoA表達均高于其他兩組。采用阿魏酸鈉干預后，肝硬化小鼠肝臟RhoA的表達見降低(P<0.05)，見圖5。阿魏酸鈉干預后，模型組小鼠肝臟Rho-kinase的含量見減低(P<0.05)，見圖6。

正常對照組 模型組 給藥組

3 討論

CCl4系一種常見的具有選擇性肝毒性化學物質，其通過活化HSC，達到誘導肝臟正常組織向纖維化轉變進程[10]。現研究發現，各種類型肝臟損害常常呈現出肝纖維化這一共同病理征象[11]，其是一種早期并且具有可逆的肝臟損害，如臨床上能及早干預，常能表現出一定的修復潛力[12]。因此，早期預防和及早干預是阻止肝纖維化進程的關鍵[13]，但研究發現肝纖維化的發病機制異常復雜，且多種細胞、細胞因子等參與疾病進程，因此探索研究抑制肝纖維化進程，并能使其減退的抗纖維化藥物具有極高價值[13]。本研究顯示阿魏酸鈉能夠有效抑制小鼠肝臟組織纖維化，其影像學指標(形態結構、回聲改變、彈性、硬度)、肝功能指標(AST、ALT)和肝纖維化指標(HA、LN、CⅣ、PⅢP)，并結合其肝臟組織病理學檢查，發現阿魏酸鈉治療下，能夠有效改善小鼠肝臟纖維化變程度以及膠原沉積范圍；聯合免疫組化檢測下肝臟組織中RhoA，Rho-kinase的含量，發現模型組RhoA及Rho-kinase水平都明顯高于正常對照組和給藥組，因此能較為全面地證明阿魏酸鈉具有保護肝臟組織和抑制肝纖維化的作用。RhoA和Rho-kinase體現為活化的HSC中表達[14]，并參與HSCs激活及肝臟纖維化進展，該信號通道通過調節血管平滑肌的舒張及收縮，從而發揮促進HSC活化的作用，并導致肝細胞外基質出現過度纖維化增生[15]。只有活化狀態RhoA(GTP-RhoA)才能發揮激活Rho-kinase并誘發其下游效應。RhoA和Rho-kinase含量的顯著減少，提示由RhoA活化并引起的下游效應受到抑制。GGPP為RhoA起活化的重要因素[16]，阿魏酸鈉極有可能通過抑制GGPP生產，從而抑制RhoA和Rho-kinase通路的激活[17]。

正常對照組 模型組 給藥組

正常對照組 模型組 給藥組

綜上所述，本研究不僅證實了阿魏酸鈉對CCl4-花生油誘導的小鼠肝纖維化具有抑制作用，而且通過分子生物學手段研究發現，阿魏酸鈉發揮抗肝纖維化作用的機制可能是通過抑制RhoA和Rho-kinase信號通路的激活，降低GGPP、α-SMA、α-SMA、ROCK、eNOS、Colla-genI、Colla-genⅢ的表達[18]，調節TIMP/MMP的平衡，抑制HSCs的激活，降低ECM的合成來發揮作用的。