宮頸鱗癌組織中miR-590-3P、FoxM1及Cdc25B細胞核內蛋白水平與高危型HPV感染的相關性研究*

黃璽瑞 廖艷芳 唐 劍 鄒偉文 任 潔 宋楚瑩 朱 正

廣東省深圳市龍崗中心醫院 1 病理科 2 婦產科 518000

宮頸鱗癌屬于臨床上較為常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，具有較高的發病率以及死亡率，已成為嚴重威脅女性生命健康安全的重大疾病之一，受到國內外的重點關注[1-2]。人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是乳頭多瘤空泡病毒科乳頭瘤病毒屬，其中HPV16、18屬于高危型HPV，若出現持續感染，會增加宮頸癌發生的風險，亦是宮頸癌發生的關鍵因素之一[3-4]。宮頸細胞學以及高危型HPV檢測是目前臨床上用以篩查宮頸癌的重要手段，但兩者均有靈敏度以及特異度相對不高的局限性。微小RNA-26a(microRNA-26a，miR-590-3P)是近年來所發現的一種miRNA，可能通過靶向調控多種下游基因或(和)蛋白的表達，繼而對多種腫瘤細胞的遷移以及侵襲產生影響，介導了宮頸癌的發生、發展過程[5]。另有免疫組織化學檢測發現，叉頭盆蛋白質M1(Fork head basin protein M1，FoxM1)及細胞分裂周期因子25B(Cell division cycle factor 25B，Cdc25B)可能在人宮頸癌以及癌前病變組織中存在異常表達[6]。鑒于此，本文通過研究宮頸鱗癌組織中miR-590-3P、FoxM1及Cdc25B細胞核內蛋白水平與高危型HPV感染的相關性，旨在為臨床宮頸鱗癌的早期診斷提供新的靶點和思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2014年2月—2019年12月醫院通過宮頸活檢、錐切以及子宮切除獲取的宮頸組織標本300份納入研究。將其按照疾病類型的差異分作正常組織59例，宮頸上皮內瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)1組織62例，CIN2/3組織101例，宮頸鱗癌組織78例。入選標準[7]：(1)所有受試者既往均無其他惡性腫瘤疾病史；(2)正常組織來源均為既往無宮頸癌或CIN病史，且無細胞學異常病史者；(3)年齡≥20歲；(4)入院前均未接受相關治療；(5)所有受試者均進行為期6個月的隨訪觀察。剔除標準：(1)合并嚴重感染性疾病、全身免疫系統疾病者；(2)神志異常或合并神經系統疾病者；(3)參與其他研究者；(4)研究過程中因各種原因退出或失訪者。研究對象均在同意書上簽字，獲得醫院倫理委員會批準，審批號為20140403。

1.2 研究方法 (1)采用實時熒光定量PCR檢測不同組織中的miR-590-3P表達水平：取不同宮頸組織100mg于液氮內研磨成粉，以Trizol一步法完成RNA的提取，并以異丙醇法進行RNA的濃縮，采用分光光度計測定總RNA純度，加權變性凝膠電泳檢測總RNA質量。嚴格遵循實時熒光定量PCR試劑盒完成擴增。反應條件如下：95℃預變性30s，95℃ 5s，60℃ 30s，共40個循環。以2-ΔΔCt法表示miR-590-3P表達水平。其中miR-590-3P引物購自上海生工生物工程有限公司；Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自北京鼎國公司。(2)以免疫組織化學法檢測FoxM1、Cdc25B蛋白表達情況：對組織進行常規石蠟包埋，并做厚度為3μm的連續切片，常規脫蠟水化，以EnVsion+兩步法以及二氨基聯苯胺顯色，分別滴加一抗、二抗，具體操作遵循相關說明書完成。其中一抗、二抗均購自丹麥DAKO公司。(3)基因型HPV DNA的檢測：采用中國國家藥品監督管理局所推薦的聚合酶鏈反應—反向點雜交法HPV基因分型檢測試劑盒完成，具體操作務必遵循試劑盒說明書完成，相關試劑盒購自亞能生物技術有限公司，共可檢測23種HPV亞型。

1.3 觀察指標 比較不同宮頸組織中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表達情況，高危型HPV感染情況。分析宮頸鱗癌組織中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表達情況與高危型HPV感染的相關性，以及miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白診斷CIN2+效能的ROC曲線。

2 結果

2.1 不同宮頸組織中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表達情況評價 CIN2/3組織以及宮頸鱗癌組織中的miR-590-3P表達水平均高于正常組織、CIN1組織，且CIN1組織中的miR-590-3P表達水平高于正常組織(F=46.873，P=0.000)；CIN2/3組織以及宮頸鱗癌組織中的FoxM1蛋白陽性率及Cdc25B蛋白陽性率均高于正常組織以及CIN1組織，且CIN1組織中的FoxM1、Cdc25B蛋白陽性率均高于正常組織(χ2=47.293、51.041，P=0.000、0.000)，見表1。

表1 不同宮頸組織中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表達情況評價

2.2 不同宮頸組織中高危型HPV感染情況評價 CIN2/3組織以及宮頸鱗癌組織中的高危型HPV感染率均為100.00%，明顯高于正常組織、CIN1組織，且CIN1組織中的高危型HPV感染率為59.68%，明顯高于正常組織的22.03%(χ2=67.293，P=0.000)，見表2。

表2 不同宮頸組織中高危型HPV感染情況評價

2.3 miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表達情況與高危型HPV感染的相關性分析 經Spearman相關性分析可得：宮頸鱗癌組織中miR-590-3P、FoxM1、Cdc25B蛋白表達率均和高危型HPV感染呈正相關(P均<0.01)，見表3。

表3 宮頸鱗癌組織中的miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白表達情況與高危型HPV感染的相關性分析

2.4 miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白診斷CIN2+效能的ROC曲線分析 經ROC曲線分析發現：miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白聯合檢測診斷CIN2+的曲線下面積、靈敏度、特異度分別為0.884、0.90、0.88，均高于上述三項指標單獨檢測，見表4。

表4 miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白診斷CIN2+效能的ROC曲線分析

2.5 高危型HPV感染影響因素的Logistic回歸分析 經Logistic回歸分析發現：高危型HPV感染的獨立危險因素涵蓋年齡、性伴侶人數以及生殖道炎癥(均P<0.05)。見表5。

表5 高危型HPV感染影響因素的Logistic回歸分析

3 討論

隨著近年來相關研究的不斷深入，越來越多的學者認為宮頸鱗癌的發生主要危險因素涵蓋以下幾點[8-10]：(1)性行為：若女性開始性生活的年齡較小，或是在身體尚未完全發育成熟的情況下開始性生活，會對其子宮造成嚴重的損害。(2)月經和分娩：包括經期階段不注重個人衛生、經期不穩定以及早婚、早育、多產等。(3)性生活：通過性生活而傳播的疾病極易引起女性發生宮頸炎癥，如不予以及時有效的治療會對宮頸造成長期刺激，繼而增加了宮頸癌發生風險。(4)吸煙：煙草中所含有的尼古丁會導致女性機體對外界感染的抵抗力下降，從而影響其對HPV感染的清除，誘發宮頸癌的發生。然而，高危型HPV感染是引起宮頸上皮內瘤變以及宮頸癌發生的重要因素，應予以足夠的重視[11-13]。

miR-590-3P作為一種新近發現的miRNA，其抑癌基因的作用已在胃癌以及肺腺癌等多種惡性腫瘤中得以佐證[14-15]。FoxM1作為轉錄因子，于細胞周期循環中主要對G1/S以及G2/M轉換相關重要基因起到轉錄調控作用，其功能和細胞增殖密切相關，且涉及有絲分裂、凋亡、染色體分離以及DNA損傷修復等多個環節，于腫瘤發生、發展過程中起著至關重要的作用。細胞周期的不同階段中，FoxM1蛋白可在細胞質之間穿梭，且在進入細胞核后的轉錄調控依賴促有絲分裂信號刺激以及Raf/MEK/MAPK通路活化[16-18]。Cdc25B在細胞核內的滯留會對有絲分裂的順利完成發揮至關重要的作用，而離開細胞核的Cdc25B不僅遠離自己的作用底物，甚至會多種蛋白相結合，繼而無法有效識別靶蛋白，進一步導致了G2期阻滯，促使細胞周期發生停滯，進一步引起損傷修復機制的啟動，介導腫瘤的發生、發展過程[19-20]。本研究發現，宮頸鱗癌組織中miR-590-3P以及FoxM1及Cdc25B蛋白表達明顯升高。提示在臨床實際工作中可能通過聯合檢測上述三項指標表達情況，繼而實現對宮頸鱗癌的輔助診斷。與此同時，本研究經ROC曲線分析發現：miR-590-3P以及FoxM1、Cdc25B蛋白聯合檢測診斷CIN2+的效能較佳。考慮原因可能是上述基因、蛋白在宮頸CIN以及宮頸鱗癌中表達兼具共性和差異。此外，miR-590-3P可能通過調控PI3K-AKT信號通路，繼而影響下游靶基因的表達，進一步參與了宮頸癌的發生發展過程。Cdc25B于細胞周期中扮演著G2/M轉換關鍵基因的角色，其在一定程度上受FoxM1轉錄活化，已有相關研究報道顯示[21-22]，Cdc25B基因水平會由于過表達HPV E2而被抑制或由于過表達HVP E7而出現升高，且高危型HPV會被募集至Cdc25B基因啟動子區域。本研究發現，miR-590-3P、FoxM1及Cdc25B細胞核內蛋白水平與高危型HPV感染密切相關，值得臨床重點關注。經Logistic回歸分析發現：高危型HPV感染的獨立危險因素涵蓋年齡、性伴侶人數以及生殖道炎癥。考慮原因，可能是年輕患者的激素水平相對穩定，且免疫功能較強，對高危型HPV的防御能力較強；而性伴侶人數越多的患者可能出現重復性感染；生殖道炎癥的發生可能對宮頸上皮造成損傷，從而降低了陰道局部免疫力，導致高危型HPV感染的概率升高。

綜上所述，宮頸鱗癌組織中miR-590-3P、FoxM1及Cdc25B細胞核內蛋白水平與高危型HPV感染明顯相關，有望成為早期診斷CIN2+的潛在生物學指標，且聯合檢測上述各項指標有助于提高對宮頸鱗癌的早期診斷效能。