淫羊藿苷對人肝癌HepG2細胞的作用及其機制研究

徐佳偉 尤雯雯

浙江省麗水市中心醫院藥學部 (浙江 麗水， 323000)

肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，5年存活率為18%，是僅次于胰腺癌的第二大致命性腫瘤[1]。肝癌的發生是一個多步驟的過程，由外界刺激引起肝細胞或干細胞的基因改變，導致增殖、凋亡抑制、發育異常和腫瘤形成[1]。目前，晚期肝癌的預后和治療效果仍然很差。尋找有效的藥物并了解其作用機制非常重要。

淫羊藿苷(ICA)是從淫羊藿屬植物中提取的一種黃烷醇糖苷，具有抗氧化、神經保護、骨保護、抗炎和抗腫瘤等多種藥理作用[2]。近年來，淫羊藿苷已被證明在各種類型的人類癌細胞中具有抗癌作用，包括結腸癌[3]、胃癌[4]、卵巢癌[5]和非小細胞肺癌等[6]。早期體外研究表明，淫羊藿苷抑制肝癌細胞增殖并誘導其凋亡[7]，但ICA對肝癌細胞的抑制作用機制尚不明確。因此，本文旨在探討淫羊藿苷對人肝癌HepG2細胞的影響及 其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ICA(純度>98%)購自中國藥品生物制品檢定所，以20 mM的濃度溶解在二甲基亞砜(DMSO)中作為儲備溶液，儲存于-20℃，并在使用前用培養基稀釋。Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)購自Gibco，細胞計數試劑盒(CCK-8)購自廣州益源生物科技有限公司。膜聯蛋白V(Annexin V)-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒購自KeyGEN生物技術公司。CH-223191(AHR拮抗劑)購自Selleckchem，用DMSO溶解。抗體Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4、芳烴受體(AHR,#83200)和β-actin (#3700)購自Cell Signaling Technology。BCA 蛋白定量試劑盒、 細胞裂解液購自碧云天生物技術研究所。

1.2 人肝癌細胞培養 人肝癌HepG2細胞購自中國科學院細胞庫，細胞在37℃、5% CO2條件下培養于含有10%胎牛血清的DMEM中。

1.3 CCK-8法測定細胞增殖 用細胞計數試劑盒-8(CCK-8)測定細胞活力。每孔100 μl的培養基在96孔板中接種的5 000個細胞，施加不同濃度的ICA(0-40 μM)或DMSO分別培養24 h、48 h和72 h，每孔細胞用10 μl CCK-8溶液在37℃的5% CO2培養箱中孵育2 h，最后用酶標儀在450 nm處測定吸光度。為了確定AHR在ICA處理的HepG2細胞中的作用，在有或沒有ICA(20 μM)培養的細胞中施用不同濃度的AHR拮抗劑CH223191(0-20 μM)，如上測定吸光度。

1.4 集落形成試驗 HepG2細胞以1×103個/孔的密度接種于6孔板中，有或沒有ICA(20 μM )培養，當平板上形成可見的克隆時，用PBS洗滌菌落，用甲醇(0.5 ml/孔)室溫固定20 min，然后用PBS洗滌3次，室溫下用0.5%結晶紫染色30 min。染色細胞用PBS清洗5次，在室溫下風干2 h。在顯微鏡(奧林巴斯MTV-3)下計數含有>50個細胞的集落。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡 細胞接種在6孔板中過夜培養，施加不同濃度的ICA或DMSO孵育48 h，孵育結束后，用細胞周期染色試劑盒進行細胞周期分析。先用70%冰冷乙醇固定細胞，在4℃孵育過夜，冷PBS洗滌，100 μl RNase處理30 min，再懸浮在400 μl碘化丙啶(PI)培養基中，在黑暗室溫下孵育30 min。用BD LSR Ⅱ流式細胞儀軟件分析細胞周期分布。細胞凋亡按Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測。處理后的細胞用胰蛋白酶消化，離心制粒，然后用PBS洗滌兩次。然后用5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI溶液在20℃黑暗中染色15 min，最后用400 μl的Annexin V結合緩沖液對細胞進行染色，BD LSR Ⅱ流式細胞儀對各組細胞凋亡率進行分析。

1.6 蛋白免疫印跡檢測相關蛋白表達水平 細胞用裂解緩沖液在冰上裂解20 min，然后在4℃下16 000 g離心15 min。BCA試劑盒檢測上清液中的蛋白質濃度。用SDS-PAGE(12%)分離每個泳道40 μg上清液蛋白的樣品，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上，封閉1 h后，將膜與一抗(1∶1 000)在4℃孵育過夜，然后將膜與含有辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶3 000)在25℃孵育1 h。采用增強型化學發光儀(ECL)檢測免疫反應條帶，并用圖像采集系統拍攝。

1.7 統計學方法 所有結果都表示為至少3個獨立實驗的平均值±標準差。采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析，使用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ICA抑制肝癌細胞增殖 與DMSO組相比，ICA以劑量和時間依賴的方式抑制肝癌細胞增殖(圖1A～C)。同樣，ICA(20 μM )處理的肝癌HepG2細胞的集落形成能力顯著低于DMSO組(P<0.001，圖1D～E)。

圖1 ICA對肝癌細胞增殖能力的影響 A～C：CCK8測定不同濃度的ICA處理肝癌HepG2細胞24、48和72 h后的細胞增殖抑制率；D～E：ICA(20 μM)處理肝癌HepG2細胞的集落形成能力；與DMSO(ICA 0 μM)組比較，*P<0.05，***P<0.001

2.2 ICA誘導肝癌細胞周期阻滯 ICA增加了HepG2細胞的G0/G1細胞周期階段的細胞數量百分比(P<0.001，圖2A)，通過蛋白印跡分析評估參與細胞周期過程的蛋白表達，結果提示ICA以劑量依賴性方式降低CDK4和cyclinD1蛋白表達(P<0.001，圖2B)，這些結果證實了ICA誘導肝癌細胞的細胞周期停滯。

圖2 ICA對肝癌細胞細胞周期的影響 A：流式細胞測定不同濃度的ICA處理肝癌HepG2細胞的細胞周期；B：通過蛋白印跡分析CDK4和cyclinD1蛋白的表達。與DMSO(ICA 0 μM)組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 ICA促進肝癌細胞凋亡 ICA顯著提高了HepG2細胞早期凋亡細胞的百分比，并呈劑量依賴性方式誘導了細胞凋亡(P<0.05，圖3A)。同時分析細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達，發現在ICA增加了Bax和降低了Bcl-2蛋白表達(P<0.001，圖3B)。

圖3 ICA對肝癌細胞細胞凋亡的影響 A：流式細胞測定不同濃度的ICA處理肝癌HepG2細胞的細胞凋亡；B：通過蛋白印跡分析Bcl-2和Bax蛋白的表達。與DMSO(ICA 0 μM)組比較， *P<0.05，***P<0.001

2.4 ICA通過激活AHR途徑發揮其抗細胞增殖作用 ICA增加HepG2細胞AHR蛋白表達的水平(P<0.01，圖4A)。接著，我們通過用AHR拮抗劑CH223191培養來確定ICA對HepG2細胞的作用是否減弱。用CH223191(1、10和20 μM)培養對體外HepG2細胞的增殖沒有顯著影響，而ICA(20 μM)對HepG2細胞增殖的影響被CH223191作用消除(P<0.05，圖4B)。用CH223191培養后降低ICA (20μM)培養HepG2細胞中AHR水平(P<0.001，圖4C)。這些結果表明ICA對細胞增殖的影響至少部分依賴于體外HepG2細胞中的AHR信號傳導。

圖4 ICA對肝癌細胞AHR途徑的影響A：蛋白印跡分析ICA處理后AHR蛋白的表達；B：CCK8測定不同濃度CH223191處理對ICA存在的細胞增殖的影響；C：蛋白印跡分析CH223191對ICA處理后AHR蛋白表達的影響。與DMSO(ICA 0 μM)組比較，**P<0.01，***P<0.001，與ICA (20 μM)組比較， ##P<0.01，###P<0.001

3 討論

肝癌是癌癥相關死亡的常見原因，HCC占原發性肝癌的80%～90%[1]。盡管 HCC的治療策略在不斷進步，但其總體預后仍然很差。越來越多的文獻研究中藥在肝癌中的抗腫瘤活性[8]。淫羊藿苷的抗腫瘤活性在體外和體內的腫瘤中均得到了廣泛的研究和報道，但其確切的抗腫瘤機制還有待揭示[9]，我們的研究表明，ICA在體外對人肝癌HepG2細胞具有抗癌作用。ICA可抑制HepG2細胞的集落形成和增殖，誘導肝癌細胞周期阻滯和細胞凋亡，從機制上，我們通過AHR抗結劑評估了ICA可能通過激活AHR抑制細胞增殖。

據報道，ICA可抑制多種腫瘤細胞增殖，且沒有明顯的副作用[2,3,6]。先前的研究表明，細胞周期停滯在G0/G1期可以抑制HepG2細胞的增殖[10]。朱燕輝等報道，ICA能誘導肝癌細胞株SMMC-7721阻滯于G0/G1期并抑制其凋亡[11]。在本研究中，淫羊藿苷顯著增加了G0/G1細胞的比例，并降低S期細胞比例，表明淫羊藿苷抑制肝細胞增殖，阻止細胞進入S期。此外，CDK4和cyclinD1作為細胞周期進程中的重要蛋白，可以誘導細胞從G1進展到S期[10]。我們觀察到ICA顯著降低細胞周期蛋白CDK4和cyclinD1的表達，這支持了細胞周期阻滯于G0/G1期。細胞凋亡失衡是腫瘤發生的主要機制之一。已經表明淫羊藿苷在體外可能通過降低Bcl-2、升高Bax蛋白的表達促進肝癌細胞的凋亡[11]。本研究的結果與之前的報道一致，提示ICA能誘導HepG2細胞凋亡，并激活凋亡標記蛋白Bax和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達。

AHR在多種腫瘤中均高度表達并長期激活，其激活的生理作用在致癌作用中起關鍵作用[12]。Liu等結果提示AHR表達的增加與肝細胞癌的進展有關，并且可能在肝細胞癌的治療中發揮潛在作用[13]。之前的研究的表明，抗AHR的內源性配體通過AHR激活顯著抑制HCC細胞HCCLM3和SMMC-7721細胞的增殖，并通過改變相關蛋白的表達來誘導G0/G1期阻滯和凋亡[14]。因此，我們研究了AHR信號在肝細胞癌增殖和凋亡影響中的作用，結果顯示ICA對HepG2細胞增殖的影響被AHR的一種特異性拮抗劑CH223191阻斷。綜上，ICA抑制人肝癌HepG2細胞的增殖和誘導細胞周期阻滯于G0～G1期，并誘導細胞凋亡，其機制可能與AHR信號的激活有關。