同型半胱氨酸和維生素B12及葉酸在糖尿病視網膜病變中的含量變化及臨床意義

孫洪巖，羅小玲，孟 婷，范皎潔，胡 衍，王 君，張思靜，趙慧攀，楊明明

0 引言

隨著人口老齡化和人均生活水平的變化，糖尿病(diabetes mellitus,DM)發病率逐年增加，成為影響全球數百萬人的疾病之一，是一種危及全球的慢性非傳染性疾病。而糖尿病視網膜病變(daibetic retinopathy,DR)是DM最常見的微血管并發癥，發病率逐年增高，病因也是多種多樣，已成為目前我國工作年齡人群第一位的致盲性眼病[1-2]。DR主要由微血管損傷引起，發病機制復雜，多種傳導通路參與其中。其中，糖尿病病程、高血糖、高血壓及高脂血癥被證明是DR的高危因素[3]。有研究表明，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)與眼血管閉塞性疾病有關，血漿Hcy水平可能是2型糖尿病患者DR風險增加的一個有用的生物標志物或新的危險因素[4,5]。同時葉酸和維生素 B12(vitamin B12,VitB12)參與體內重要的代謝過程，也是Hcy在體內代謝的重要輔酶，其含量的變化對Hcy在體內代謝的水平有重要影響[6-7]。本研究通過檢測DM及DR患者血清中的Hcy、VitB12及葉酸的濃度，分析其變化，并進一步探討血清Hcy在DR中的作用及其意義。

1 對象和方法

1.1對象采用病例對照研究設計，選取2021-07/2022-01在深圳市人民醫院眼科經熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography, FFA)確診的DR患者95例作為DR組。DR患者納入標準：(1)有DM 病史；(2)經FFA確診，眼底出現微血管瘤、硬性滲出、棉絨斑及新生血管病灶；排除標準：(1)先天性屈光不正；(2)眼部疾病：視神經炎、青光眼等；(3)精神疾病：抑郁癥、躁狂癥、睡眠障礙等。同期選取在內分泌科診治的2型DM患者94例作為DM組。依據1999年糖尿病診斷標準[8]進行診斷。DM組納入標準：糖尿病病程大于5a且經FFA檢查無視網膜微血管病的患者；排除標準：(1)經FFA檢查已出現DR的患者；(2)有精神類疾病等。另選在我院眼科診治的單純年齡相關性白內障患者87例作為正常對照組，納入標準：無DM 病史，血糖水平滿足空腹血糖<7.0mmol/L，隨機血糖<11.1mmol/L，糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c, HbA1c)<6.5%；排除標準：糖尿病病史、其他全身性疾病如炎癥性疾病，如炎癥性腸炎、風濕病等、急慢性感染性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病等。三組受檢者均進行常規腎功檢查，檢查結果均無異常者才可納入試驗研究。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，本研究方案經深圳市人民醫院倫理委員會審核批準。所有受檢者均為自愿參加并簽署知情同意書。

1.2方法收集三組受檢者性別、年齡、身高、體質量、體質量指數(body mass indx，BMI)、血壓、現病史、既往史等基本信息。患者入院后次日晨起抽取空腹肘靜脈血4mL，常規離心處理，轉速為3 000r/min，離心10min，抽取上層血清，-70℃保存備用，送檢驗科采用酶聯免疫定量法測定Hcy的濃度，化學發光免疫法檢測 VitB12 和葉酸的濃度。應用AU5800 Beckman Coulter K.K全自動生化分析儀測定總膽固醇(cholesterol,CHOL)、三酰甘油(triglyceride,TG)、載脂蛋白A(apolipoprotein A，APOA)、載脂蛋白B(apolipoprotein B,APOB)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的水平。

2 結果

2.1三組受檢者基本資料比較三組受檢者性別構成比比較，差異無統計學意義(P=0.723)；年齡、糖尿病病程、空腹血糖、HbA1c、收縮壓及舒張壓比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，進一步兩兩比較的結果見表1。三組受檢者血清VitB12濃度比較，差異無統計學意義(F=2.951，P=0.054)，血清Hcy和葉酸濃度比較，差異均有統計學意義(F=238.943，P<0.001；F=44.384，P<0.001)，進一步兩兩比較結果見表2。三組受檢者臨床生化指標比較顯示：三組受檢者APOA和LDL比較差異均無統計學意義(F=2.318，P=0.100；F=2.532，P=0.081)，CHOL、TG、APOB、HDL濃度比較差異均有統計學意義(F=17.424，P<0.001；F=24.553，P<0.001；F=3.065，P=0.048；F=35.987，P<0.001)，進一步兩兩比較結果見表3。

表1 三組受檢者基本資料比較

表2 三組受檢者血清中Hcy和VitB12及葉酸濃度比較

表3 三組受檢者各臨床生化指標比較

2.2DM組和DR組患者血清中Hcy和VitB12及葉酸與臨床生化指標的相關性分析Pearson線性相關性分析結果顯示：DM組患者血清中Hcy濃度與血糖、HbA1c呈正相關(r=0.205，P=0.048；r=0.416，P<0.001)，與LDL呈強相關(r=0.820，P<0.001)；DM組VitB12濃度與HbA1c和LDL呈弱正相關(r=0.248，P=0.016；r=0.307，P=0.003)。DR組患者血清中Hcy的濃度與TG、LDL呈弱正相關(r=0.208，P=0.043；r=0.240，P=0.019)；DR組VitB12的濃度與HbA1c呈弱負相關(r=-0.278，P=0.006)。其余指標未見明顯相關性(表4)。

表4 DM組和DR組患者血清中Hcy和VitB12及葉酸與臨床生化指標的相關性分析

2.3影響DR組患者血清中Hcy濃度的多因素線性回歸分析將年齡、性別、BMI、收縮壓、舒張壓、CHOL、TG、APOA、APOB、HDL及LDL均以自變量的形式輸入多因素線性回歸分析中，結果顯示LDL(β=0.471,P=0.019)被認為是影響DR組患者血清Hcy濃度的重要因素。

2.4DR組患者血清中Hcy和VitB12及葉酸濃度的ROC曲線分析ROC曲線顯示血清中Hcy診斷價值高于VitB12及葉酸，曲線下面積為0.867，大于0.5，說明Hcy對DR的診斷有重要意義(表5，圖1)。

圖1 DR組患者血清中Hcy和VitB12及葉酸濃度的ROC曲線。

表5 DR組患者血清中Hcy和VitB12及葉酸濃度的ROC曲線分析

3 討論

DR是一種常見的眼科并發癥，主要發生在視網膜微血管系統，據估占全球失明人群的5%，但DR發病機制復雜，是多種因素、多機制共同作用的結果[9]。其中，氧化應激是重要的一環，研究表明，DR的發生與氧化應激密切相關，視網膜組織缺血缺氧，體內自由基產生增多以及抗氧化劑的減少均可引起視網膜的損傷，導致血眼屏障破壞[10-11]。近年來的研究顯示，Hcy在DR的發生發展中發揮重要作用[12]。Hcy是一種含硫基的氨基酸，生理水平的Hcy可以維持體內含硫氨基酸的平衡，但Hcy的非生理性增高則被認為是很多疾病的的危險因素。Hcy含有巰基，可自動氧化，會產生過氧化氫、超氧化物陰離子自由基、羥自由基等，產生氧化應激反應，從而對血管內皮細胞的功能造成損傷[13]。在甲硫氨酸合酶的作用下，Hcy被催化成甲硫氨酸，其中 5-甲基四氫葉酸是底物，VitB12是該酶的輔酶，如VitB12、葉酸缺乏或代謝過程中一些酶的缺陷都會導致Hcy代謝和清除受限，從而引起Hcy濃度升高[14]。有試驗研究表明，DM組Hcy水平高于正常對照組，DM 患者可通過增加胰島素抵抗、血脂異常和血糖控制不佳而使Hcy水平升高，Hcy 水平升高與DM 的發生、發展呈因果關系[15-16]。同時，Hcy與許多視網膜疾病有關，包括視網膜靜脈阻塞、年齡相關性黃斑變性、血管內皮功能障礙及視網膜色素上皮破壞等[17-19]。最近的一項研究表明，DR患者的Hcy水平比非糖尿病患者高3倍[20]。

本試驗研究發現，Hcy的濃度在正常對照組、DM組、DR組中依次升高，且差異有統計學意義。在苗新穎等[21]最先研究中表明，DR組Hcy的水平高于非DR組，增殖型組Hcy水平也明顯高于非增殖型組，且Hcy水平與DR病情程度呈正相關，這與我們的試驗結果吻合，證明了隨著病程延長、疾病嚴重程度的加大，Hcy的水平也隨之升高，進一步說明Hcy參與DR的發生發展，在DR中扮演重要的角色。而正常對照組受檢者血清中VitB12及葉酸的濃度要高于DM組及DR組，這也證實了，在糖尿病患者中，長期的糖代謝紊亂導致VitB12及葉酸的濃度減少，進而導致Hcy的濃度增加，進而加劇視網膜氧化應激的損傷，影響內皮細胞的功能。Hcy可通過脂質過氧化反應導致視網膜血管的通透性增強，血漿蛋白滲漏于毛細血管基底膜，刺激基底膜內皮細胞增殖，導致DR的發生[22]。我們的相關性分析得出，DM組中Hcy的濃度與血糖、HbA1c呈正相關，與LDL呈強正相關；朱崇軒等[23]研究也證實了高水平的Hcy和HbA1c可增加DM患者發生DR的風險，對于疾病的早期干預有重要意義。糖尿病患者的LDL比來自非DM患者的LDL更容易受到體外同型半胱氨酸化的影響，糖尿病患者的Hcy-LDL的組成變化對人內皮細胞具有細胞毒性作用[24]。

在本試驗中，DR組患者血清中Hcy的濃度與TG、LDL呈弱正相關；多因素線性回歸分析結果顯示，在眾多影響因素中，LDL被認為是影響DR組血清Hcy濃度的重要因素。有專家證實，血清高Hcy可以通過影響脂質代謝，使得脂質過氧化和抗氧化過程受損，激發氧化應激，使機體發生相應損傷[25-26]，本試驗也恰巧證實了這一點。同時，ROC曲線顯示曲線面積大于0.5，說明Hcy是DR的危險因素，對DR的診斷有重要意義。在常亮等[27]最新研究中體現，對血清Hcy水平預測2型DR效能分析時，曲線下面積為0.922，預測價值非常理想，這與我們的試驗結果也是相符合的。

當然本研究也存在一定的局限性：(1)本研究樣本量相對較小，且各因素之間相關系數值較小，由于該研究是基于醫院患者人群，且DR及糖尿病是典型的多因素疾病，可能存在一定的干擾，對此影響因素的探討仍需擴大樣本量進一步研究；(2)患者基線及治療情況差異大，正常對照組選擇單純年齡相關性白內障人群，雖然在較大程度上排除了炎癥的參與，但某些混雜因素仍可能影響對結果的解讀。因此，在今后的研究中，需要擴大樣本量，對血清中Hcy及其影響因素需進行全面分析和探索。

基于以上結果，我們有理由得出，測定血清中Hcy、VitB12及葉酸的濃度對DR的預防有重要意義，可以通過調控三者的含量變化來延緩或控制DR的發展。