狗頭赤芍質量標準的提升研究

蔡遠東 薛朝金 李天佑 何 羽

貴州省畢節市市場監督管理局檢驗檢測中心，貴州 畢節 551700

狗頭赤芍為毛茛科植物美麗芍藥PaeoniamaireiLévl.、草芍藥PaeoniaobovataMaxim.的干燥根。春、秋二季采挖，除去根莖、須根及雜質，干燥。其功能為活血化瘀，涼血調經。用于瘀滯胸脅疼痛、腹痛、目赤、痛經、經閉、衄血、跌撲損傷[1]。美麗芍藥主要分布于貴州畢節、威寧等地，草芍藥主要分布在貴州麻江、錦屏、威寧、赫章、水城、遵義等地[2-3]。根據相關報道[4]，狗頭赤芍主要化學成分為芍藥苷、 羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內酯苷(白芍苷)、 芍藥新苷、 芍藥苷元酮等。芍藥苷具有保肝、保護神經細胞、保護缺血性的腦損傷及神經損傷的作用，還具有抗抑郁作用、抑制炎癥作用[5]。沒食子酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等活性[6]。狗頭赤芍收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》(2003年版)，標準只對其粉末進行了顯微鑒別，不能全面反映藥材整體質量。本文采用HPLC法同時測定狗頭赤芍中沒食子酸和芍藥苷的含量，為質量標準的提升提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀，2998二極管陣列檢測器。電子天平：MSE3.6P-OCE-DM，由賽多利斯科學儀器(北京)有限公司生產；電子天平：AY120、BX420H由梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產。潔康超聲波清洗機(超聲功率：360 W，超聲頻率：40 KHz)由東莞市潔康超聲波設備有限公司生產。

1.2 試藥 沒食子酸對照品(批號：110831-201602，含量以90.8%計)、芍藥苷對照品(批號：110736-202044，含量以96.8%計)均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純(美國TEDIA天地試劑公司)，實驗用水為娃哈哈純凈水，稀乙醇：取乙醇(95%，天津市富宇精細化工有限公司)529 mL，加娃哈哈純凈水稀釋至 1000 mL,即得稀乙醇。

1.3 樣品信息 采集的樣品經貴州省中藥研究所陳德媛老師鑒定，為毛茛科植物草芍藥PaeoniaobovataMaxim。樣品詳見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL- Packed- Column 5C18-MS-II 4.6ID×250 mm；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；流速為1 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為30 ℃；進樣量：10 μL。梯度洗脫程序見表2，色譜圖如圖1，各成分分離度皆大于1.5。

表2 梯度洗脫表

1.沒食子酸；2.芍藥苷；A.試劑空白；B.對照品溶液；C.供試品溶液

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品沒食子酸、芍藥苷適量，加稀乙醇制成每1 mL含沒食子酸、芍藥苷分別為0.042 mg、0.052 mg的混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，粉碎，研細，取約0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率：360 W，頻率：40 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得[7]。

2.4 線性關系考察 精密量取“2.2”項下的混合對照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度。分別精密吸取10 μL，按“2.1”項下的色譜條件測定，每個樣品進樣2次。以對照品濃度(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標進行線性回歸。得到沒食子酸和芍藥苷線性回歸方程、相關系數，結果見表3。

表3 沒食子酸和芍藥苷線性范圍及回歸方程 (n=5)

2.5 精密度試驗 取“2.2”項下的混合對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件重復測定5次，分別計算2種成分的峰面積積分值。結果沒食子酸、芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.5%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取畢節市赫章縣鐵匠鄉采集的狗頭赤芍藥材，粉碎，研細，取粉末5份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，每份平行測定2次，按“2.1”項下的色譜條件測定并計算各成分的含量。結果顯示狗頭赤芍中沒食子酸、芍藥苷的平均值分別為0.31%，2.28%；RSD值分別為1.33%、1.84%。表明方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取畢節市赫章縣鐵匠鄉采集的狗頭赤芍藥材，粉碎，研細，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h進樣，按“2.1”項下的色譜條件測定并計算各組分峰面積的RSD值，結果沒食子酸、芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.50%、1.60%。說明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收試驗 取畢節市赫章縣鐵匠鄉采集的狗頭赤芍藥材，粉碎，研細，稱取粉末6份，每份約0.25 g，加入沒食子酸、芍藥苷濃度分別為0.7258 mg/mL、5.4015 mg/mL的混合對照品溶液1 mL，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下測定并計算回收率。回收率平均值分別為99.58%、99.84%，RSD分別為1.17%、0.45%。結果見表4。

表4 狗頭赤芍中兩種成分的回收率試驗結果

2.9 樣品含量的測定 取不同產地的狗頭赤芍樣品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，每份平行測定2次，按“2.1”項下的色譜條件測定并計算各成分的含量。測定結果見表5。

表5 不同產地狗頭赤芍中沒食子酸和芍藥苷的含量 (%)

結果按干燥品計算，樣品中沒食子酸的含量為0.30%～0.47%，平均值為0.4%；芍藥苷的含量為2.28%～3.24%，平均值為2.7%。從含量測定的結果看出，芍藥苷的含量均高于《中國藥典》(2020版)“赤芍”的含量限度1.8%，本品可以作為赤芍的替代品使用。沒食子酸含量較高的樣品，芍藥苷含量也相對較高，如產于畢節市赫章縣和威寧縣的樣品，含量的高低是否與地域和植物的生長周期有關，還待進一步的研究。

3 討論

本研究分別采用甲醇-0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，結果用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液時，芍藥苷色譜峰拖尾較嚴重，選用乙腈-0.1%磷酸溶液時，目標峰峰形較好，且與相鄰雜質峰達到完全分離，取得了滿意的效果。

采用稀乙醇為溶劑，分別考察了超聲處理15 min、30 min和45 min，結果超聲處理15 min時，樣品含量較低，超聲處理30 min和45 min時樣品含量相差不大，說明超聲處理15 min時，目標成分未提取完全，超聲處理30 min和45 min時目標物提取較完全，為保證充分提取完全和縮短實驗室操作時間，本次研究選擇超聲處理30 min。分別取稀乙醇、甲醇和50%甲醇作為溶劑，超聲處理30 min，結果發現稀乙醇提取時目標物含量較高，故本研究采用稀乙醇為提取溶劑。

本實驗采用HPLC法分別同時測定了5個不同產地的狗頭赤芍中的沒食子酸和芍藥苷的含量，取得了較為滿意的結果。該方法較為簡便，重復性較好，可用于狗頭赤芍的含量測定及質量評價，為狗頭赤芍質量標準的提升提供方法依據。