廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

向燕芬 鄧桂珠 甘國(guó)興* 盧 泳 龍國(guó)斌 朱衛(wèi)星

1.廣東省清遠(yuǎn)市中醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2.廣東省鮮藥民族醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心，廣東 清遠(yuǎn) 511500

廣東紫珠是馬鞭草科植物廣東紫珠CallicarpakwangtungensisChun.的干燥莖枝和葉，具有收斂止血、散瘀、清熱解毒的功效[1]。目前有關(guān)于廣東紫珠化學(xué)成分、藥理作用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究報(bào)道[2-7]，但是沒(méi)有關(guān)于廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究報(bào)道。本研究制備廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑并評(píng)價(jià)其質(zhì)量，為廣東紫珠不同的飲片用藥形式之間劑量換算提供參考，提高臨床用藥的準(zhǔn)確性和療效的一致性。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備 e2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)，XS205型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，F(xiàn)E28型pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)， RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，等。

1.2 試劑與藥材 連翹酯苷B對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，純度98.46%，批號(hào)：MUST-20111105)，色譜純磷酸為上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；色譜純乙腈及分析純甲醇均為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；超純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；廣東紫珠藥材在集貿(mào)市場(chǎng)收集。

2 方法與結(jié)果

2.1 廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 收集10批廣東紫珠藥材，參考《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》[8]的方法，分別稱取廣東紫珠藥材100 g，置于3000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量水，浸泡30 min，加熱回流提取30 min，趁熱用200目篩過(guò)濾，藥渣加8倍量水，加熱回流提取20 min，趁熱用200目篩過(guò)濾，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃減壓濃縮至500 mL，即得0.2 g·mL-1的廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2 廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH測(cè)定 采用pH計(jì)測(cè)定10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH，重復(fù)3次，取平均值為廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH。10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH為4.4～5.3，平均pH為4.6。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率 精密量取廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑25 mL,置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速稱定重量，計(jì)算廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率，重復(fù)3次，取平均值為廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率。10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為11.9%～26.1%，平均出膏率為21.8%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH和出膏率

2.4 廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜建立及評(píng)價(jià)

2.4.1 色譜條件 Phenomenex Gemini? C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，0～35 min，5%A，95%B；35～40 min，5%～9%A，95%～91%B；40～55 min，9%～10%A，91%～90%B；55～80 min，10%A，90%B；80～81 min，10%～11A，90%～89%B；81～91 min，11%A，89%B；91～92 min，11%～10%A，89%～90B；92～130 min，10%A，90 %B；130～131 min，10%～12%A，90 %～88%B；131～151 min，12%～13%A，88 %～87%B；151～175 min，13%～14%A，87 %～86%B；柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)332 nm，進(jìn)樣量5 μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 取連翹酯苷B對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度54.153 μg·mL-1，過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，進(jìn)樣量5 μL。

2.4.3 供試品溶液制備 取標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均<4.5%，表明儀器具有良好的精密度。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均<4.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品6份，按2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，2.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果各色譜峰相保留時(shí)間的RSD均<1.1%，相對(duì)峰面積的RSD均<4.8%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.7 指紋圖譜分析 將10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”(2012版)，采用中位數(shù)法和多點(diǎn)矯正法，時(shí)間寬度0.9 min，生成相應(yīng)的對(duì)照指紋圖譜1，其中共有峰10個(gè)，通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)出8號(hào)峰為連翹酯苷B。相似度分析結(jié)果表明，10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照指紋圖譜相似度均大于0.90，符合標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度要求(大于0.90)。結(jié)果見(jiàn)表2，如圖1。

表2 10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度

A.廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜；B.連翹酯苷B對(duì)照品色譜圖；C.對(duì)照指紋圖譜

2.4.8 指紋圖譜聚類分析(HCA) 采用 SPSS 26.0 數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間聯(lián)接法，測(cè)量區(qū)間為歐氏距離，聚類結(jié)果見(jiàn)圖2，10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑可分為2類，GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX7為第1類，GD1、GD2、GD3為第2類。

圖2 10批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HCA樹狀圖

2.4.9 主成分分析(PCA) 選擇10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的10個(gè)共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入 SIMCA-P+12.0軟件進(jìn)行 PCA 處理，得分矩陣圖見(jiàn)圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 10 批樣品聚為2組，GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX7為一組，GD1、GD2、 GD3為第2組，與 HCA 結(jié)果一致。

圖3 10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的PCA得分

2.4.10 正交偏最小二乘法判別分析 (OPLS-DA) 將10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的10個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入 SIMCA-P+12.0軟件進(jìn)行OPLS-DA處理，得分矩陣圖如圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 10 批樣品聚為2組，GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX7為一組，GD1、GD2、 GD3為第2組，且與 PCA 和 HCA 結(jié)果一致。圖5中的點(diǎn)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明對(duì)應(yīng)變量(色譜峰)權(quán)重值越大，結(jié)合以變量重要性投影(VIP)值>1 為判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異組分，如圖6。結(jié)果共找到1個(gè)已知成分連翹酯苷B。

圖4 10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的OPLS-DA得分矩陣圖

圖5 10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的OPLS-DA載荷散點(diǎn)圖

圖6 10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑OPLS-DA的VIP值圖

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中要求藥材樣品需具有代表性，收集的藥材樣品應(yīng)不少于10批，盡可能包括不同產(chǎn)區(qū)的藥材樣品。本研究收集廣東紫珠藥材10批，其中廣西產(chǎn)7批、廣東產(chǎn)3批，未能收集到湖南和江西產(chǎn)的藥材樣品。《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中要求采用加熱回流提取和減壓濃縮的方法制備標(biāo)注湯劑。因此，根據(jù)廣東紫珠藥材的特點(diǎn)，選擇浸泡時(shí)間為30 min，采用加熱回流提取，第一次加10倍量水，提取30 min，第二次加8倍量水，提取20 min，合并濾液后減壓濃縮制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià) 《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中要求以pH、出膏率范圍、成分轉(zhuǎn)移率范圍、指紋圖譜或特征圖譜等指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量。本研究中，10批廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH為4.4～5.3，平均pH為4.6，符合《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》中各批次值在均值加減3倍SD范圍的要求；出膏率為11.9%～26.1%，平均出膏率為21.8%，廣東產(chǎn)的出膏率均低于廣西的；各批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.90，符合《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中相似度不低于0.90的要求。由于在藥店和醫(yī)療機(jī)構(gòu)無(wú)法買到廣東紫珠飲片，本研究所用廣東紫珠的種植時(shí)間和存放時(shí)間均無(wú)法確定，其指標(biāo)成分含量可能存在較大差異，所得成分轉(zhuǎn)移率范圍沒(méi)有指導(dǎo)意義，因此本研究未測(cè)定廣東紫珠中連翹酯苷B和金石蠶苷的含量，計(jì)算其成分轉(zhuǎn)移率。

3.3 指紋圖譜條件選擇 本研究根據(jù)2020年版中國(guó)藥典第一部，考察了265 nm、254 nm和332 nm 3個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)以332 nm為波長(zhǎng)，色譜峰數(shù)量較多，面積較大，色譜圖基線最佳。在332 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，分別考察了甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水等流動(dòng)相的色譜圖情況。甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，色譜圖峰數(shù)量較少，峰形較差，基線較差，色譜峰分離度較差。乙腈-0.05%甲酸水為流動(dòng)相，色譜圖峰形較好，但峰面積較大的色譜峰分離度較差。乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)量較多，色譜峰分離度較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水為廣東紫珠標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的流動(dòng)相。

本研究參考《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》的要求制備了10批廣東紫珠藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并以pH、出膏率、指紋圖譜等為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。但是由于在藥店和醫(yī)療機(jī)構(gòu)無(wú)法買到廣東紫珠飲片，本研究收集的廣東紫珠產(chǎn)地較少，也沒(méi)有測(cè)定廣東紫珠指標(biāo)性成分連翹酯苷B和金石蠶苷的含量，計(jì)算化學(xué)成分轉(zhuǎn)移率，存在一定的不足。今后如果能收集到合適的廣東紫珠飲片，將進(jìn)一步補(bǔ)充完善相關(guān)研究，使結(jié)果更加科學(xué)合理。