牛結核病γ-干擾素檢測技術

1 技術概述

1．1 技術基本情況

牛結核病是由牛結核分枝桿菌引起的人畜共患慢性傳染病。近年來，人結核病陽性檢出率逐年上升，世界衛生組織在1993年4月宣布“全球結核病緊急狀態”，1998年又重申“遏制結核病的行動刻不容緩”，并將每年3月24日定為“世界防治結核病日”。據報道，約有10.6%的人結核病是由牛分枝桿菌引起的，牛結核病中的7%是由人結核桿菌引起。2002—2020年大理市共檢測奶牛52 761頭，檢測出陽性404頭，陽性率0.77%，奶牛結核病依然威脅著廣大人民的健康。根據奶牛結核病檢測技術標準，檢測奶牛結核病的方法為單純頸部皮內變態反應實驗、比對頸部皮內變態反應實驗和結核病γ-干擾素ELISA實驗。皮內變態反應實驗非特異性反應較高容易造成誤殺，而且耗費人力、財力和時間較多，存在人為因素影響結果的準確性等現象。結核病γ-干擾素ELISA實驗敏感性和特異性較皮內變態反應都高，是檢測奶牛結核病的最佳方法。

1．2 示范技術推廣情況

結核病γ-干擾素ELISA實驗已寫入奶牛結核病檢測技術標準，適合大范圍推廣，在新疆、內蒙古、山西等省（市）均有推廣。

1．3 提質增效情況

2021年大理市動物疫病預防控制中心在規模化養殖場用結核病γ-干擾素ELISA、結核分枝桿菌ELISA、結核病對比皮內變態反應實驗3種方法進行牛結核病檢測凈化，累計監測374頭，共檢出結核病陽性畜25頭。經評估，排除可疑結果50頭，排除假陽性34頭，降低了49.57%的成本，為農戶挽回經濟損失60萬元以上。牛結核病γ-干擾素檢測技術可快速準確診斷牛結核病，為牛結核病防控提供科學依據。

2 技術要點

2．1 實驗基礎條件

（1）實驗室基礎建設。實驗室要通過獸醫實驗室認證，具備開展奶牛結核病檢測等實驗的條件和資質，有足夠的面積，相對獨立功能區，配備酶標儀、自動洗板機、微量震蕩器、生物安全柜、普通離心機、生物顯微鏡、恒溫培養箱、生化培養箱、PCR儀等齊全的血清學檢測及核酸檢測儀器設備，基本達到實驗操作要求標準及生物安全標準。

（2）實驗室管理體系。要求有完善的管理體系，制定《質量管理手冊》《生物安全管理規定》《獸醫實驗室生物安全管理手冊》《程序文件》《實驗室安全保衛制度》《實驗室廢棄物處理制度》《實驗室人員準入制度》《實驗室生物安全人員培訓、考核制度》《實驗室生物安全自查制度》《實驗室消毒管理制度》《獸醫實驗室生物安全管理制度》《獸醫實驗室生物安全管理手冊》《獸醫實驗室生物安全應急預案》《獸醫實驗室意外事故應急處置措施》等一系列制度措施，并不斷完善各項管理制度。

（3）實驗室檢測能力。獸醫實驗室要求有固定的專職技術人員，可開展酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、血清學檢測、實時熒光PCR、細菌分離、培養、鑒定，血常規檢查、血液生化指標檢查、尿液常規檢查等。

2．2 結核病γ-干擾素ELISA實驗簡介

（1）參照標準及適用范圍。參照《動物結核病診斷技術》GB/T 18645—2020。用于檢測牛全血培養上清中的牛γ-干擾素，根據檢測牛PPD、禽PPD和PBS刺激全血后上清中γ-干擾素量的不同判斷牛結核的感染情況。

（2）實驗原理。牛γ-干擾素實驗是以刺激培養全血為基礎，檢測牛結核病的一種實驗方法。通常感染分支桿菌的牛，其血液中的淋巴細胞能識別特異的分支桿菌抗原（包括結核菌素PPD），淋巴細胞識別分支桿菌抗原的過程涉及細胞因子的產生和釋放，γ-干擾素就是其中最重要的一種。用結核菌素(PPD)刺激培養牛全血，全血中的T淋巴細胞就會識別PPD，發生細胞免疫反應，其中一個直接的表現就是產生并釋放γ-干擾素。γ-干擾素可用γ-干擾素特異的單克隆抗體夾心法檢測。其他資料背景參考《牛γ-干擾素ELISA檢測試劑盒》的說明書。

（3）操作程序及安全性。實驗存在一定風險，但風險較小。陽性反應的上清中可能含有分支桿菌，要求所有操作步驟嚴格遵守操作規程及實驗室生物安全相關規章制度。

器材包括酶標儀、Ⅱ級生物安全柜、二氧化碳培養箱或生化培養箱、混勻儀、冰箱（2～8 ℃或-15 ℃以下）、電子天平、高壓消毒鍋、微量可調移液器及吸頭、一次性無菌離心管（2 mL或1.5 mL）、一次性肝素鋰或肝素鈉抗凝采血管、一次性注射器（5 mL、10 mL、20 mL）或一次性采血針、一次性無菌注射器等。

試劑為《牛γ-干擾素ELISA檢測試劑盒》、去離子水等。

操作方法：①抗凝血采集。用采血針或注射器無菌采集全血4 mL以上，立刻轉移至肝素鋰或肝素鈉抗凝采血管中，輕輕顛倒混勻3～5次，18～25 ℃保存，30 h內送達實驗室進行刺激培養。②全血培養。將抗凝血輕輕顛倒混勻，無菌分裝于培養容器，每份血液樣品分裝3孔，每孔加入定量全血，分別加入定量PPD-B、PPD-A和PBS，輕輕振蕩混勻，置37 ℃培養一定時間，收集上清，立即用于檢測，或保存于-15 ℃以下備用。③ELISA檢測。用ELISA方法檢測上清液中的γ-干擾素。④分析數據。根據試劑盒說明調整酶標儀波長，讀取OD值，確定實驗結果成立與否，判定陰陽性。

2．3 結核病γ-干擾素ELISA實驗推廣應用

2021年在規模化養殖場推廣結核病γ-干擾素ELISA實驗，發現結核病γ-干擾素ELISA實驗在實際應用中優勢明顯，同時也存在一定的不足，因此通過進一步推廣探索出更優化的結核病γ-干擾素ELISA實驗及相關推廣方式。

（1）結核病γ-干擾素ELISA實驗，1個實驗周期約24 h，通過推廣探索縮短實驗周期的方法。

（2）結核病γ-干擾素ELISA實驗技術要求用去離子水，通過推廣探索使用市面上售賣的飲用純凈水替代去離子水，使該實驗方法更容易在基層應用。

（3）通過結核病γ-干擾素ELISA實驗不同試劑盒實驗結果比對，篩選出敏感性和特異性更高的試劑盒。

（4）通過推廣，探索出結核病γ-干擾素ELISA實驗關鍵細節，通過改進，優化實驗方法及推廣方式。

3 適用區域

技術適用于在大理市乃至大理州牛規模化養殖場（戶）推廣應用。

4 注意事項

一是采血過程注意生物安全，尤其注意個人防護及全血不得污染。二是全血應低溫保存，不能污染、腐敗、冷凍。三有相關實驗室及實驗設備的配套。四是培養全血時應注意溫度要恒定在37 ℃，要防止污染。五是做ELISA洗板時，在拍干后不能留有氣泡，不能長時間干燥。六是顯色時應注意避光，加樣后應注意混勻。七是注意記錄的完整性與規范性，做到有痕跡資料可追溯。

5 技術依托單位

大理市動物疫病預防控制中心、大理州動物疫病預防控制中心。