抗氧化乳酸菌的篩選及其對(duì)小腸上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

王小鵬，崔文明，王子卓越，楊文月，黃宇琪，李靜蕊，陳水燕，郭培培，趙改名, ，閆 爽,

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南鄭州 450002；3.河南花花牛乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司乳工程研究院，河南鄭州 450064）

正常代謝產(chǎn)生的適量活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）發(fā)揮著細(xì)胞內(nèi)信息傳遞、生化反應(yīng)調(diào)節(jié)等重要作用[1]，但衰老、虛弱、肥胖等生理病理因素都會(huì)加速體內(nèi)ROS的產(chǎn)生[2]，過(guò)量的ROS會(huì)破壞機(jī)體氧化和抗氧化平衡，造成氧化應(yīng)激，損傷生物體的蛋白質(zhì)、脂類及核酸等成分，引發(fā)高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥狀硬化等疾病[3-4]。生物體具有抗氧化酶類和非酶分子組成的防御修復(fù)系統(tǒng)，如細(xì)胞可產(chǎn)生超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）來(lái)抵御ROS的損傷[5]。然而，當(dāng)體內(nèi)ROS積累過(guò)高時(shí)，內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)無(wú)法消除活性氧自由基對(duì)人體的傷害，補(bǔ)充外源性抗氧化劑成為應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的有效方式。正丁基羥基茴香醚和正丁基羥基甲苯等合成抗氧化劑能夠有效減輕氧化損傷，但由于對(duì)肝臟有損害并存在致癌風(fēng)險(xiǎn)，其安全性受到質(zhì)疑[6]。

乳酸菌具有抗氧化特性，能夠減輕氧化應(yīng)激對(duì)生物體的影響[7]。Song等[8]從泡菜中分離到一株短乳桿菌B13-2，其具有較高的DPPH和ABTS+自由基清除能力以及脂質(zhì)過(guò)氧化抑制活性，經(jīng)85 ℃、30 min熱處理后，菌體仍具有抗氧化活性。Zhang等[9]研究了植物乳桿菌J26發(fā)酵對(duì)藍(lán)莓汁抗氧化能力的影響，結(jié)果表明發(fā)酵藍(lán)莓汁的DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力顯著增強(qiáng)，與抗氧化性密切相關(guān)的酚類物質(zhì)、花色苷含量明顯升高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究也表明，乳酸菌能夠緩解生物體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，乳雙歧桿菌HN019能夠改善健康個(gè)體和代謝綜合征患者的炎癥和氧化應(yīng)激指標(biāo)，且對(duì)健康受試者顯示出特定的抗氧化防御作用[10]。乳酸菌作為生物抗氧化劑，正在受到更多的研究和關(guān)注。

基于產(chǎn)業(yè)需求，眾多研究關(guān)注了抗氧化乳酸菌的篩選和體外抗氧化指標(biāo)測(cè)定[6,11]，乳酸菌對(duì)正常腸道細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用及細(xì)胞中抗氧化酶活性的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道。目前，不良飲食習(xí)慣、焦慮等社會(huì)環(huán)境因素對(duì)人們腸道健康造成極大影響，其中氧化損傷是重要方面。小腸黏膜上皮細(xì)胞（IEC-6）保留了小腸上皮干細(xì)胞未分化的特性，在組織學(xué)和免疫學(xué)方面與增殖性隱窩細(xì)胞無(wú)明顯差別，而且在合適條件下，能分化為成熟的腸細(xì)胞，是研究外源性物質(zhì)對(duì)小腸作用效果的良好模型[12]。相對(duì)于HT-29和Caco-2等結(jié)腸癌細(xì)胞系，IEC-6細(xì)胞更適合研究乳酸菌菌株對(duì)小腸功能的影響作用。

本研究通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，從長(zhǎng)壽老人腸道菌群中篩選出3株高抗氧化活性乳酸菌菌株，分析其對(duì)小腸上皮細(xì)胞（IEC-6）的細(xì)胞黏附能力并通過(guò)H2O2誘導(dǎo)構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型，探索菌株對(duì)IEC-6細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用，以及對(duì)細(xì)胞中GSHPx、SOD、CAT等抗氧化酶活性和MDA（malondialdehyde）生成量的影響，為潛在功能性食品添加劑或食品配料開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌菌株 分離自河南省周口市夏邑縣長(zhǎng)壽老人糞便；大鼠小腸上皮細(xì)胞（IEC-6，CRL-1592TM）美國(guó)ATCC公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒（glu-tathione peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、總抗氧化能力試劑盒（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛試劑盒（malonaldehyde，MDA） 南京建成生物工程研究所；溶菌酶（＞20 kU/mg） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒 日本Dojindo公司；過(guò)氧化氫、鄰苯三酚、鄰二氮雜菲、鐵氰化鉀等生化試劑 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

Biometra T-Gradient梯度PCR儀 德國(guó)Biometra公司；EC3 310凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；UV2600紫外分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；HVE-50自動(dòng)高壓滅菌器 日本Hirayama公司；SW-CJ-2FD超潔凈工作臺(tái) 江蘇蘇凈集團(tuán)公司；Thermo 371 CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；VCX750超聲破碎儀 美國(guó)Sonics Materials公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)及菌體裂解液的制備 取出凍存于甘油管（-80 ℃）中的36株乳酸菌菌株，接種至MRS液體培養(yǎng)基中，傳代3次。菌株按照2%接種量在MRS液體培養(yǎng)基中，置于厭氧培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)18 h后，利用平板涂布計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)，4000×g離心5 min，菌體細(xì)胞重懸于無(wú)菌PBS緩沖液中，調(diào)整細(xì)菌濃度為1×109CFU/mL，該菌懸液用于后續(xù)研究。

待測(cè)菌株菌懸液（1×109CFU/mL）中加入溶菌酶（1 mg/mL），37 ℃培養(yǎng)30 min，冰浴條件下超聲破碎（250 W，超聲5 s，間隔10 s，共10 min），8000×g離心10 min，收集上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，得到菌株裂解液。

1.2.2 菌株的過(guò)氧化氫耐受能力分析 菌株過(guò)氧化氫耐受能力分析參照Das等[13]的方法，待測(cè)菌株按照1%接種量分別接種于H2O2濃度為0.8 mmol/L的MRS液體培養(yǎng)基和不含H2O2的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)8 h，600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定培養(yǎng)液吸光度值，以不含H2O2的樣品作為空白。

1.2.3 DPPH自由基清除能力分析 取2 mL的DPPH-無(wú)水乙醇溶液（400 μmol /L），加入2 mL待測(cè)菌株混勻，室溫避光靜置30 min，8000×g離心10 min，測(cè)定上清液在517 nm的吸光度值[14]。DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

式中：A0為等體積無(wú)水乙醇代替樣品的吸光度值；A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度值；A2為等體積無(wú)水乙醇代替DPPH乙醇溶液的吸光度值。

1.2.4 羥自由基清除能力分析 將1 mL鄰二氮雜菲（2.5 mmol/L）、1 mL的PBS（pH7.4）、0.5 mL待測(cè)菌株混合均勻，隨后加入1 mL的FeSO4溶液（2.5 mmol/L）和0.5 mL的H2O2（20 mmol/L），37 ℃水浴1 h，檢測(cè)其在536 nm波長(zhǎng)處的吸光度值[15]。羥自由基清除率計(jì)算公式為：

式中：A0為等體積水代替樣品的吸光度值；A1為等體積水分別代替樣品和H2O2的吸光度值；A2為含樣品和H2O2的吸光度值。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除能力分析 取3.4 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH8.2）、0.5 mL鄰苯三酚溶液（50 mmol/L），加入1 mL待測(cè)菌株，混合均勻后放入25 ℃的培養(yǎng)箱反應(yīng)4 min，隨后加入0.1 mL的HCl溶液（8 mol/L）終止反應(yīng)，測(cè)定其在320 nm的吸光值[2]。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式為：

式中：A0為等體積水代替樣品的吸光度值；A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度值。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng) IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、90% DMEM（4 mmol/L的L-谷氨酰胺、1 mmol/L的丙酮酸鈉、4.5 g/L的葡萄糖）和100 U/L牛胰島素的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO2濃度為5%，隔天換液1次，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代，第15～20代對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞用于本研究。

1.2.7 細(xì)胞黏附能力分析 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)參照Song等[8]的方法。IEC-6細(xì)胞以每孔6×105個(gè)的濃度接種于96孔板中，完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至6×103/孔，貼壁24 h后再無(wú)血清培養(yǎng)12 h使細(xì)胞同步于G0期，吸出無(wú)血清培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入100 μL待測(cè)菌株（109CFU/mL），37 ℃培養(yǎng)2 h，PBS洗滌去除未黏附細(xì)菌，隨后加入Triton X-100，使黏附細(xì)菌從細(xì)胞脫落，初始細(xì)菌數(shù)及黏附細(xì)菌數(shù)統(tǒng)計(jì)均采用平板涂布計(jì)數(shù)。細(xì)胞黏附率公式如下：

式中：A0為初始細(xì)菌數(shù)量；A1為黏附細(xì)菌數(shù)量。

1.2.8 細(xì)胞氧化損傷模型建立 細(xì)胞氧化損傷模型參照朱靜靜等[16]的方法建立并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果稍作修改。96孔板上調(diào)整IEC-6細(xì)胞細(xì)胞密度至6×103/孔，貼壁24 h后再無(wú)血清培養(yǎng)12 h使細(xì)胞同步于G0期，吸出無(wú)血清培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入200 μL不同濃度（0、50、75、100、125、150 μmol/L）的H2O237 ℃培養(yǎng)4 h后，吸去H2O2，PBS洗滌。隨后采用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞存活率，即向每孔加入含10 μL CCK-8溶液的無(wú)血清培養(yǎng)液110 μL，37 oC孵育90 min，測(cè)定各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm）。CCK-8試劑盒方法測(cè)定細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下：

式中：A0為無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基的吸光度值；A1為正常培養(yǎng)組的吸光度值；A2為H2O2處理組的吸光度值。

1.2.9 細(xì)胞存活率、丙二醛含量及抗氧化酶活力分析 IEC-6細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板中，無(wú)血清培養(yǎng)基使細(xì)胞同步于G0期，PBS洗滌后加入2 mL含有菌株裂解液的培養(yǎng)基（菌株的無(wú)細(xì)胞裂解液和完全培養(yǎng)基以1:1混合），37 ℃培養(yǎng)24 h。PBS洗滌，100 μmol/L的H2O2處理4 h。隨后進(jìn)行細(xì)胞存活率、丙二醛含量及抗氧化酶活力的分析。其中，細(xì)胞存活率采用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞存活率，具體方法同1.2.8；丙二醛含量及抗氧化酶活力分析參照Liu等的方法并稍作改動(dòng)[2]，即每孔中加入1 mL 1%的Triton-X-100，冰上裂解10 min，離心后取上清液（8000×g，5 min），根據(jù)試劑盒方法測(cè)定不同處理組的GSH-Px、T-SOD、CAT活性，T-AOC值及MDA含量。

具體分組和實(shí)驗(yàn)處理如下：空白組不添加菌株裂解液，不經(jīng)H2O2損傷處理；損傷組不添加菌株裂解液，經(jīng)H2O2損傷處理；實(shí)驗(yàn)組添加菌株裂解液，經(jīng)H2O2損傷處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式表示，并采用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，顯著水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株H2O2耐受能力

H2O2是一種長(zhǎng)效氧化劑，可通過(guò)直接氧化損傷或作為羥自由基的前體物質(zhì)，加速細(xì)胞衰老過(guò)程甚至殺死細(xì)胞[17]。抗氧化菌株能夠抵御一定程度H2O2造成的氧化損傷，同等培養(yǎng)條件下，菌株抗氧化能力越強(qiáng)，菌株生長(zhǎng)受H2O2影響越小。一定濃度范圍內(nèi)，培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度與液體光密度（OD值）成正比，因此可以利用菌液的OD600值來(lái)分析菌株生長(zhǎng)情況[18]。

36株分離菌株的H2O2耐受能力如表1所示。空白組各菌株的OD600為2.34～2.76，不同菌株生長(zhǎng)情況有差異；實(shí)驗(yàn)組各菌株經(jīng)0.8 mmol/L H2O2共培養(yǎng)8 h后，OD600為0.36～1.27，所有菌株生長(zhǎng)都受到一定程度抑制，但不同菌株對(duì)H2O2脅迫的抗性不同。高抗氧化菌株經(jīng)0.8 mmol/L H2O2處理8 h后，菌株對(duì)氧化損傷抗性較高，OD600通常大于1.0[13]，本研究初篩實(shí)驗(yàn)組OD600＞1.0的16株菌株用于后續(xù)抗氧化實(shí)驗(yàn)。

表1 分離菌株的H2O2（0.8 mmol/L）耐受能力Table 1 Tolerance of H2O2 (0.8 mmol/L) of the isolated strains

2.2 菌株的DPPH自由基清除能力

DPPH自由基性狀穩(wěn)定，是一種常見(jiàn)的抗氧化效果評(píng)價(jià)方法，可用于篩查乳酸菌的抗氧化活性[19]。由表2可知，16株乳酸菌都有一定的DPPH自由基清除能力（16.28%～57.16%），不同菌株清除DPPH自由基能力有較大差異，HN-04、HN-05、HN-15的DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，分別為54.31%、57.16%和52.81%。乳酸菌的DPPH自由基清除能力與其分泌到菌體表面和代謝產(chǎn)物中的胞外多糖有關(guān)，這些多糖類物質(zhì)通過(guò)氫原子和電子轉(zhuǎn)移，中和DPPH自由基[20]。王英等[21]從傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中分離出29株乳酸菌，除發(fā)酵乳桿菌P13（DPPH自由基清除率為73.02%）外，其余菌株的DPPH自由基清除率在10.81%～62.68%之間，結(jié)果與本研究基本一致。

表2 分離菌株的DPPH自由基清除能力Table 2 DPPH radical scavenging ability of the isolated strains

2.3 菌株的羥自由基清除能力

羥自由基清除劑可猝滅體系中強(qiáng)氧化性的羥自由基，保護(hù)生物分子免受氧化損傷影響。乳酸菌菌體表面存在Fe2＋和Cu2＋等過(guò)渡金屬離子的螯合物質(zhì)，能夠抑制芬頓反應(yīng)（Fenton reaction），防止羥自由基的生成[22]。如表3所示，16株乳酸菌均具有一定的羥自由基清除能力（18.03%～52.38%），不同菌株清除羥自由基能力有較大差異，其中HN-04、HN-05、HN-15的羥自由基清除能力較強(qiáng)，分別為48.10%、52.38%、47.44%。張俊等[23]從甘南傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵酸奶中篩選出6株乳酸菌，菌株的羥自由基清除率為14.03%～36.92%，略低于本研究數(shù)據(jù)，這可能是由于菌株的羥自由基清除能力和菌株自身特性有關(guān)。

表3 分離菌株的羥自由基清除能力Table 3 Hydroxyl radical scavenging ability of the isolated strains

2.4 菌株的超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基和羥基結(jié)合后，會(huì)破壞細(xì)胞DNA，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)細(xì)胞和生物體造成損傷[24]。由表4可知，16株乳酸菌均具有一定的超氧陰離子自由基清除活性（12.98%～43.31%），不同菌株的超氧陰離子自由基清除能力不同，其中HN-04、HN-05、HN-15超氧陰離子自由基清除率較高，分別為42.06%、43.31%、37.11%。乳酸菌清除超氧陰離子自由基的能力，與其代謝產(chǎn)生的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等抗氧化酶類有關(guān)[6]。李穎等[25]發(fā)現(xiàn)7株人源植物乳桿菌的超氧陰離子自由基清除能力為49.99%～54.04%，與本文研究結(jié)果接近。

表4 分離菌株的超氧陰離子自由基清除能力Table 4 Superoxide anion radical scavenging ability of the isolated strains

綜合菌株的DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力分析結(jié)果，選擇抗氧化性較強(qiáng)的HN-04、HN-05、HN-15進(jìn)行下一步分析。

2.5 菌株的細(xì)胞黏附能力

乳酸菌對(duì)小腸上皮細(xì)胞的黏附是發(fā)揮其腸道定殖、抗菌、抗氧化等益生作用的前提條件。乳酸菌通過(guò)表面特異性識(shí)別分子和宿主靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體，在空間結(jié)構(gòu)上相互匹配并結(jié)合。乳酸菌的黏附能力除與菌體和細(xì)胞直接相關(guān)外，也受外界溫度、酸堿度、離子強(qiáng)度等因素的影響[26]。

分離菌株對(duì)IEC-6細(xì)胞黏附作用如表5所示，HN-04、HN-05、HN-15菌株的初始細(xì)菌數(shù)分別為9.08、9.07和9.15（lg CFU/mL），和IEC-6細(xì)胞共培養(yǎng)孵育2 h后，3株菌的細(xì)胞黏附率分別為6.77%、6.92%和5.82%，HN-04和HN-05菌株的細(xì)胞黏附率顯著高于HN-15菌株（P＜0.05）。報(bào)道顯示，乳酸菌的細(xì)胞黏附率一般在2%～10%之間，不同菌株的細(xì)胞黏附率不同，明串珠菌H40、植物乳桿菌SY11和短乳桿菌KU15153對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的黏附率分別為2.86%、7.20%和8.91%[27-28]，本研究數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

表5 分離菌株的IEC-6細(xì)胞黏附能力Table 5 Adhesion ability to IEC-6 cells of the isolated strains

2.6 H2O2氧化損傷模型建立及菌株對(duì)IEC-6細(xì)胞存活率的影響

H2O2可以通過(guò)芬頓反應(yīng)、自動(dòng)氧化等途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基自由基，造成細(xì)胞的氧化損傷，直觀反映氧化還原環(huán)境失衡對(duì)細(xì)胞活性的影響，因此，可利用H2O2建立IEC-6細(xì)胞氧化損傷模型[29]。如圖1a所示，IEC-6細(xì)胞存活率隨著H2O2濃度的增加而降低，當(dāng)H2O2濃度小于100 μmol/L時(shí)，其對(duì)IEC-6細(xì)胞損傷不明顯，細(xì)胞存活率仍大于80%；隨著H2O2濃度升高，細(xì)胞存活率快速下降，當(dāng)H2O2濃度為150 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率僅為48.65%。為防止H2O2濃度太高導(dǎo)致IEC-6細(xì)胞損傷難以恢復(fù)，選取100 μmol/L的H2O2用于建立細(xì)胞氧化損傷模型。

乳酸菌能夠降低氧化劑或外源真菌毒素對(duì)細(xì)胞的毒性，提升細(xì)胞存活率，預(yù)防或修復(fù)細(xì)胞損傷[30]。由圖1b可知，HN-04、HN-05、HN-15菌株裂解液共培養(yǎng)24 h后，IEC-6細(xì)胞存活率分別提升了7.24%、11.19%和5.31%，表明3株乳酸菌對(duì)H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞損傷有一定的預(yù)防作用。Németh等[31]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌2142無(wú)論是預(yù)防處理還是共培養(yǎng)保護(hù)，都能夠顯著降低H2O2氧化損傷導(dǎo)致的Caco-2細(xì)胞凋亡。乳酸菌可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)緩解氧化損傷，例如Hou等[32]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能夠下調(diào)細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)基因（TNF、NUAK2、FBN2）表達(dá)、抑制免疫應(yīng)答和凋亡相關(guān)信號(hào)通路中基因（Jak-STAT、MAPK）的表達(dá)，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

圖1 H2O2濃度（a）和菌株裂解液（b）對(duì)IEC-6細(xì)胞存活率影響Fig.1 Effects of the H2O2 concentration (a) and the three strains (b) on the viability of the IEC-6 cells

2.7 菌株對(duì)IEC-6細(xì)胞中丙二醛含量的影響

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化的中間產(chǎn)物，可與生物大分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性和遺傳毒性，常被作為反映機(jī)體氧化損傷的指標(biāo)[22]。細(xì)胞內(nèi)的MDA由細(xì)胞膜磷脂中的脂肪酰基過(guò)氧化物分解產(chǎn)生，是前列腺素合成中環(huán)氧合酶反應(yīng)的產(chǎn)物，MDA作為氧化應(yīng)激過(guò)程中的脂質(zhì)過(guò)氧化物，可引起組織細(xì)胞損傷，其含量常用來(lái)評(píng)估氧化應(yīng)激的程度[33]。由圖2可知，H2O2氧化損傷導(dǎo)致IEC-6細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著上升，乳酸菌預(yù)處理可顯著降低MDA含量（P＜0.05）。相對(duì)于損傷組，HN-04、HN-05、HN-15菌株處理組細(xì)胞中的MDA含量分別降低了29.12%、48.80%和20.98%。乳酸菌預(yù)處理能夠降低氧化損傷模型細(xì)胞內(nèi)的MDA含量，表明3種乳酸菌能減輕H2O2引發(fā)的脂質(zhì)氧化作用，對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。

圖2 乳酸菌對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的IEC-6細(xì)胞中MDA含量的影響Fig.2 Effects of the three strains on MDA content in IEC-6 cells under oxidative stress induced by H2O2

2.8 菌株對(duì)IEC-6細(xì)胞中抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶類在機(jī)體抵御活性氧損傷中起著重要作用，抗氧化酶能夠迅速催化抗氧化反應(yīng)，抵御氧化應(yīng)激刺激，避免組織和細(xì)胞遭受過(guò)氧化物損害[34]。

由表6可知，H2O2處理后，IEC-6細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系活性顯著降低（P＜0.05），3株乳酸菌預(yù)處理能夠緩解抗氧化物酶系活力的下降趨勢(shì)。氧化損傷使IEC-6細(xì)胞中的GSH-Px、T-SOD、CAT活性和T-AOC值分別降低32.53%、54.06%、56.89%和60.91%；相對(duì)于損傷組，乳酸菌HN-04、HN-05、HN-15預(yù)處理可使細(xì)胞中GSH-Px、T-SOD、CAT和T-AOC值分別增加12.03%～32.39%、21.20%～47.42%、36.10%～87.14%和23.55%～48.69%。一些研究關(guān)注了乳酸菌對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響，植物乳桿菌Y16發(fā)酵產(chǎn)物能夠提升氧化損傷HepG2細(xì)胞株中的SOD、GSH-Px、CAT酶活性，提高細(xì)胞存活率[30]。植物乳桿菌C88、干酪乳桿菌Zhang能夠增強(qiáng)受試動(dòng)物血清中的SOD、GSH-Px、CAT酶活性，減輕氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷[22,35]。SOD、CAT和GSHPx是機(jī)體防御和消除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的重要屏障，T-AOC反映了機(jī)體非酶抗氧化防御體系能力，3株乳酸菌能夠提升氧化模型細(xì)胞中的抗氧化酶活性和T-AOC值，這一結(jié)果和3株乳酸菌的自由基清除效果一致。

表6 乳酸菌對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的IEC-6細(xì)胞抗氧化酶活性的影響Table 6 Effects of the three strains on antioxidant enzyme activities in IEC-6 cells under oxidative stress induced by H2O2

3 結(jié)論

通過(guò)H2O2初篩及DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力分析，從河南夏邑長(zhǎng)壽老人腸道中篩選得到具備抗氧化活性的發(fā)酵乳桿菌HN-04、植物乳桿菌HN-05、動(dòng)物雙歧桿菌HN-15。3株菌作用于H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞損傷模型后，均能夠提高氧化損傷細(xì)胞的存活率，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（12.03%～32.39%）、超氧化物歧化酶（21.20%～47.42%）、過(guò)氧化氫酶活性（36.10%～87.14%）和總抗氧化能力（23.55%～48.69%），降低丙二醛含量（20.98%～48.80%）。所篩選的3株乳酸菌可作為潛在的天然抗氧化劑應(yīng)用于功能性食品開(kāi)發(fā)。