響應(yīng)面法優(yōu)化丁酸梭菌快速增殖基礎(chǔ)培養(yǎng)基

劉瑾，趙華

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)為典型的嚴格厭氧菌，是革蘭氏陽性菌，在惡劣環(huán)境中可以通過形成芽孢增強自身對外界環(huán)境的適應(yīng)能力[1]。其芽孢具有強抗逆性，能經(jīng)受菌制劑過程中的高溫、干燥、酸堿性的侵蝕，穩(wěn)定性強[2]。芽孢在適當(dāng)?shù)臈l件下可以重新萌芽并形成細菌。與乳酸菌的抗逆性相比，在高溫下容易死亡，菌制劑的活菌數(shù)較少。丁酸梭菌的這種特性可以更好地勝任微生物飼料的任務(wù)。

丁酸梭菌具有產(chǎn)生較高濃度和純度的丁酸、較好的生長穩(wěn)定性以及較低的營養(yǎng)需求等優(yōu)點，因此被認為是最有開發(fā)潛力且具有商業(yè)性的丁酸發(fā)酵菌株[3]。丁酸梭菌具有極強的腸道整理作用，不但可以抑制腸道中大腸桿菌、沙門氏桿菌等致病菌，對腸道中有益菌群的生長有益處；同時有產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等多種酶類的能力，也可以促進動物的腸道發(fā)育和抗炎抑菌能力，起到部分抗生素的作用[4-6]。丁酸梭菌發(fā)酵生產(chǎn)的丁酸還被認為是一種抗癌劑，這主要是因為丁酸通過改變組蛋白脫乙?；_到腫瘤細胞凋亡[7]，丁酸鹽可以用于預(yù)防和治療結(jié)腸癌，抑制乳腺癌，并且在治療惡性膠質(zhì)瘤中也可以起到作用[8-9]。這些特性使丁酸梭菌及其產(chǎn)物丁酸在食品、發(fā)酵工業(yè)、飼料、醫(yī)學(xué)醫(yī)藥等多個重要領(lǐng)域中有著得天獨厚的巨大優(yōu)勢[10]。

目前微生物發(fā)酵法產(chǎn)丁酸存在丁酸產(chǎn)量較低、底物成本高、生成副產(chǎn)物導(dǎo)致丁酸得率低等問題，致使其無法滿足工業(yè)化和單一市場對丁酸梭菌制劑的需求[11-12]。采用目前傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝生產(chǎn)丁酸通常會存在丁酸生產(chǎn)速率、產(chǎn)品純度、終濃度較低等問題，不僅會導(dǎo)致發(fā)酵底物利用率低，而且會增加丁酸后續(xù)分離成本，從而使發(fā)酵法產(chǎn)丁酸無法與化學(xué)合成法競爭[13]。因此，優(yōu)化丁酸梭菌的簡易規(guī)?；a(chǎn)和高產(chǎn)量的發(fā)酵工藝在市場應(yīng)用上具有良好的研究前景[14-15]。

本課題采用單因素實驗的方法以達到使丁酸梭菌快速、大量培養(yǎng)的目的。選擇碳源、氮源以及除氧劑等進行全面優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面分析[16-17]，以提高一定體積內(nèi)丁酸梭菌的存活數(shù)量，縮短丁酸梭菌的生長周期，提供實驗依據(jù)，可使丁酸梭菌制劑和丁酸大量生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化。

1 材料與方法

1.1 菌株

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)：由天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物重點實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

強化梭菌培養(yǎng)基(reinforcedClostridialmedium，RCM)：10.0 g蛋白胨、3.0 g酵母膏、5.0 g葡萄糖、10.0 g牛肉膏、1.0 g可溶性淀粉、0.5 g鹽酸半胱氨酸、5.0 g氯化鈉、3.0 g乙酸鈉，溶于1 000 mL去離子水內(nèi)，在121 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基則要添加2%瓊脂。

優(yōu)化后快速增殖培養(yǎng)基：14.0 g葡萄糖、16.0 g酵母膏、0.9 g半胱氨酸鹽酸鹽、5.0 g氯化鈉、3.0 g乙酸鈉，溶于1 000 mL蒸餾水內(nèi)，在121 ℃滅菌20 min。

1.3 單因素實驗

1.3.1 碳源的優(yōu)化

以RCM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選取葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖作為碳源，設(shè)置8.0 g/L為單一碳源的起始添加量，其他成分保持不變，培養(yǎng)基分裝于容量250 mL的螺口試劑瓶內(nèi)，接種量為10%，每組設(shè)置3個平行，置于厭氧箱內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)4 d，間隔12 h取樣，檢測期間最高OD600，確定最佳碳源的種類。

確定最佳碳源種類后，設(shè)置單一變量，最佳碳源的添加量分別設(shè)置為8.0，10.0，12.0，14.0，16.0 g/L，接種量和培養(yǎng)條件如上所述保持不變，檢測期間最高OD600，確定優(yōu)化碳源的最佳添加量。

1.3.2 氮源的優(yōu)化

以優(yōu)化碳源種類和添加量后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選取牛肉膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨作為氮源，設(shè)置8.0 g/L為單一氮源的起始添加量，其他成分保持不變，接種量和培養(yǎng)條件如1.3.1所述，檢測期間最高OD600，確定最佳氮源的種類。

確定最佳氮源種類后，設(shè)置單一變量，最佳氮源的添加量分別設(shè)置為8.0，10.0，12.0，14.0，16.0 g/L，接種量和培養(yǎng)條件如1.3.1所述，檢測期間最高OD600，確定優(yōu)化氮源的最佳添加量。

1.3.3 除氧劑的優(yōu)化

以優(yōu)化碳源、氮源后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選取抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、亞硫酸鈉、硫代乙醇酸鈉4種除氧劑，設(shè)置0.5 g/L為單一除氧劑起始添加量，其他成分均保持不變，接種量和培養(yǎng)條件如1.3.1所述，檢測期間最高OD600，確定最佳除氧劑的種類。

確定最佳除氧劑種類后，設(shè)置單一變量，最佳除氧劑的添加量設(shè)置為0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3 g/L，接種量和培養(yǎng)條件如1.3.1所述，檢測期間最高OD600，確定優(yōu)化除氧劑的最佳添加量。

1.3.4 培養(yǎng)溫度優(yōu)化

以各項指標(biāo)綜合優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置溫度梯度為30，34，37，40 ℃，于恒溫厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每組3個平行，對應(yīng)溫度下培養(yǎng)4 d，間隔12 h取樣，檢測期間最高OD600，確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.4 響應(yīng)面法分析

在之前實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法研究各個因素對丁酸梭菌OD值的影響，并進一步確定培養(yǎng)基成分的最佳組合和最優(yōu)值。

1.5 優(yōu)化培養(yǎng)基生長曲線的測定

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分裝于250 mL螺口瓶內(nèi)，取10%丁酸梭菌培養(yǎng)液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，每隔12 h取樣檢測生物量OD600并記錄數(shù)值，繪制丁酸梭菌的生長曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源優(yōu)化

對選取的5種碳源進行單一種類優(yōu)化，結(jié)果見圖1中A；對最優(yōu)碳源的添加量進行優(yōu)化，結(jié)果見圖1中B。

圖1 不同碳源(A)和最優(yōu)碳源添加量(B)對丁酸梭菌生長的影響Fig.1 Effects of different carbon sources (A) and optimal carbon source addition amount (B) on the growth of Clostridium butyricum

由圖1中A可知，葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖都可以為丁酸梭菌的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，但其中葡萄糖的效果最為顯著，在培養(yǎng)4 d的過程中，生物量OD600最高，為0.74，因此確定丁酸梭菌可利用的最佳碳源為葡萄糖。在丁酸梭菌的生長過程中，葡萄糖提供基本的營養(yǎng)物質(zhì)，葡萄糖濃度過低時提供的營養(yǎng)物質(zhì)不足，丁酸梭菌生長受到限制，葡萄糖濃度過高導(dǎo)致培養(yǎng)基滲透壓升高，丁酸梭菌水分滲出導(dǎo)致生長受到限制甚至死亡[18]。

由圖1中B可知，葡萄糖濃度為14.0 g/L時生物量OD600達到最大值，為2.880 1，結(jié)果表明適合丁酸梭菌生長的最優(yōu)碳源為葡萄糖，且最適添加量為14.0 g/L。

2.2 氮源優(yōu)化

對選取的5種氮源進行單一種類優(yōu)化，結(jié)果見圖2中A；對最優(yōu)氮源的添加量進行優(yōu)化，結(jié)果見圖2中B。

圖2 不同氮源(A)和最優(yōu)氮源添加量(B)對丁酸梭菌生長的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources (A) and optimal nitrogen source addition amount (B) on the growth of Clostridium butyricum

由圖2中A可知，牛肉膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨都對丁酸梭菌的生長有一定的作用，其中大豆蛋白胨和酵母膏的作用尤為顯著，但酵母膏的效果最顯著，在培養(yǎng)4 d的過程中，其生物量OD600最高，為2.359 2,因此確定丁酸梭菌可利用的最佳氮源為酵母膏。

由圖2中B可知，最終確定酵母膏濃度為16.0 g/L時最優(yōu)。在培養(yǎng)的4 d內(nèi)，生物量OD600達到最大值，為2.349 9。結(jié)果表明，適合丁酸梭菌生長的最優(yōu)氮源為酵母膏，最佳添加量為16 g/L。

2.3 除氧劑優(yōu)化

對選取的4種除氧劑進行單一種類優(yōu)化，結(jié)果見圖3中A；對最優(yōu)除氧劑的添加量進行優(yōu)化，結(jié)果見圖3中B。

圖3 不同除氧劑(A)和最優(yōu)除氧劑添加量(B)對丁酸梭菌生長的影響Fig.3 Effects of different deoxidizers (A) and optimaldeoxidizer addition amount (B) on the growth of Clostridium butyricum

由圖3中A可知，抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫代乙醇酸鈉都對丁酸梭菌的生長有一定作用，而亞硫酸鈉對丁酸梭菌的生長幾乎沒有作用。其中半胱氨酸鹽酸鹽和硫代乙醇酸鈉的效果較好，效果最顯著的為半胱氨酸鹽酸鹽，在培養(yǎng)的4 d內(nèi)，其OD600生物量最大，為1.846 6。因此，確定丁酸梭菌可利用的最佳除氧劑為半胱氨酸鹽酸鹽。

由圖3中B可知，半胱氨酸鹽酸鹽添加量過低時，在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基內(nèi)達不到無氧狀態(tài)[19]，半胱氨酸鹽酸鹽濃度為0.9 g/L時生物量OD600達到最大值，為1.103 6。結(jié)果表明，適合丁酸梭菌生長的最優(yōu)除氧劑為半胱氨酸鹽酸鹽，其最適添加量為0.9 g/L。

2.4 溫度優(yōu)化

對設(shè)置的4個最優(yōu)培養(yǎng)溫度進行單一優(yōu)化，結(jié)果見圖4。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對丁酸梭菌生長的影響Fig.4 Effects of different culture temperatures on the growth of Clostridium butyricum

由圖4可知，在培養(yǎng)4 d的過程中，30 ℃和40 ℃對丁酸梭菌的生長提供的環(huán)境并不是最優(yōu)，而在37 ℃的培養(yǎng)環(huán)境下，丁酸梭菌生長最快，且OD600生物量最高，可達2.940 9。因此，可以確定丁酸梭菌的最適培養(yǎng)溫度為37 ℃。

2.5 最陡爬坡實驗

根據(jù)上述實驗，通過梯度增加葡萄糖、酵母膏和半胱氨酸鹽酸鹽的濃度，采用最陡爬坡實驗的上升實驗確定3個因素的最佳水平范圍，實驗設(shè)計和響應(yīng)值見表1。

表1 最陡爬坡實驗設(shè)計和結(jié)果Table 1 Design and results of steepest climbing experiment g/L

由表1可知，丁酸梭菌的OD值隨著梯度的增加而增加，第2梯度時，丁酸梭菌的OD值達到最大，梯度再提高，OD值下降。因此，選擇第2梯度的濃度做進一步的響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基條件

在最陡爬坡實驗的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 10.0軟件，針對葡萄糖(X1)、酵母膏(X2)和半胱氨酸鹽酸鹽(X3)對丁酸梭菌OD值(Y)的影響進行響應(yīng)面實驗，進一步確定培養(yǎng)基的最佳條件，并對結(jié)果進行方差分析，所得實驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面實驗的設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

通過Design Expert 10.0軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多元線性回歸分析，得到擬合實驗因素的回歸方程：

Y=3.66+0.049X1+0.068X2+0.095X3+0.14X1X2-0.027X1X3+0.057X2X3-1.31X12-0.76X22-0.12X32。

通過Design Expert 10.0軟件對響應(yīng)面實驗進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知，該模型的P值為0.000 1，極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著，且失擬項的P值為0.576 5>0.05，該模型和實驗擬合度較好。模型的決定系數(shù)R2為0.971 2，校正后的決定系數(shù)RAdj2為0.934 1，變異系數(shù)(coefficient of variation， C.V.)為8.03%，表示8.03%的變異不能由該模型解釋，說明實驗操作和模型均可信。

2.7 響應(yīng)面分析

根據(jù)上述分析，該模型可用于解釋和預(yù)測實驗結(jié)果，根據(jù)回歸分析和回歸方程的擬合，利用Design Expert 10.0軟件得到各因素相互作用的響應(yīng)面和等高線的分析結(jié)果，見圖5。

a

b

c

d

e

f

每個因素對丁酸梭菌OD值的綜合影響見圖5，當(dāng)半胱氨酸鹽酸鹽的濃度為0.9 g/L時，葡萄糖和酵母膏的交互作用對丁酸梭菌OD值的影響見圖5中 a和b，葡萄糖和酵母膏的濃度范圍分別為13.5～14.5 g/L和15.5～16.5 g/L；當(dāng)酵母膏濃度為16 g/L時，葡萄糖和半胱氨酸鹽酸鹽的交互作用對丁酸梭菌OD值的影響見圖5中c和d，葡萄糖和半胱氨酸鹽酸鹽的濃度范圍分別為13.5～14.5 g/L和0.7～1 g/L；當(dāng)葡萄糖濃度為14 g/L時，酵母膏和半胱氨酸鹽酸鹽的交互作用對丁酸梭菌OD值的影響見圖5中e和f，酵母膏和半胱氨酸鹽酸鹽的濃度范圍分別為15.5～16.5 g/L和0.8～1 g/L。通過Design Expert 10.0分析，酵母膏濃度為16.372 g/L，葡萄糖濃度為14.324 g/L和半胱氨酸鹽酸鹽濃度為0.905 g/L時，有最大丁酸梭菌OD值3.350 4，與以上分析一致。

為了驗證Design Expert 10.0軟件所預(yù)測的最佳實驗條件，在所提供的最佳發(fā)酵條件下，并考慮現(xiàn)實操作條件，調(diào)整最佳發(fā)酵條件為酵母膏 16 g/L、葡萄糖14 g/L、氯化鈉5.0 g/L、乙酸鈉3.0 g/L和培養(yǎng)溫度37 ℃，在此條件下進行3次平行實驗，得到發(fā)酵液丁酸梭菌OD值為3.675 3，較模型預(yù)測值3.563 7高約3.134%，此差值在可接受范圍內(nèi)。在未優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，丁酸梭菌OD為1.579 3，提高了約132.72%。

2.8 優(yōu)化培養(yǎng)基生長曲線測定

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基分裝于250 mL螺口瓶內(nèi)，取10%丁酸梭菌培養(yǎng)液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每隔12 h取樣檢測生物量OD600并記錄數(shù)值，繪制丁酸梭菌的生長曲線，見圖6。

由圖6可知，菌體在最優(yōu)培養(yǎng)基以及最適培養(yǎng)溫度的條件下，僅在2.5 d達到對數(shù)生長期，3 d時菌體生物量OD600最高，為3.350 4。雖然菌體生物量OD600最后穩(wěn)定在1左右，這主要是培養(yǎng)基過少、菌體濃度過高、營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快導(dǎo)致的[20-23]。

圖6 最優(yōu)培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)溫度的丁酸梭菌生長曲線Fig.6 Growth curve of Clostridium butyricum with optimal culture medium at optimal culture temperature

在本課題中，采取單因素實驗的方法對本實驗室提供的丁酸梭菌的RCM初始培養(yǎng)基進行成分的篩選和添加量的優(yōu)化，最終結(jié)果表明培養(yǎng)該丁酸梭菌的培養(yǎng)基最佳組分為葡萄糖、酵母膏、半胱氨酸鹽酸鹽，最優(yōu)培養(yǎng)溫度為37 ℃[24-26]。

3 結(jié)論

培養(yǎng)基成分及其含量對丁酸梭菌濃度起著至關(guān)重要的作用，碳源與氮源為丁酸梭菌生長提供了最基礎(chǔ)的營養(yǎng)，半胱氨酸鹽酸鹽作為除氧劑確保了丁酸梭菌生長條件為無氧條件，碳源、氮源的選擇與配比對丁酸梭菌的生長很重要。

響應(yīng)面分析比普通的線性模型和正交實驗更加立體全面，可以找到最優(yōu)的組合和響應(yīng)值。本實驗通過響應(yīng)面分析確定了培養(yǎng)基最優(yōu)值，結(jié)果表明，優(yōu)化后培養(yǎng)基中最佳碳源為葡萄糖(14.0 g/L)，最佳氮源為酵母膏(16.0 g/L)，最佳除氧劑為半胱氨酸鹽酸鹽(0.9 g/L)，最適培養(yǎng)溫度為37 ℃。此時丁酸梭菌生長最快速，且最大OD600值達到3.350 4，比優(yōu)化前提高約132.72%。