金種子濃香型大曲微生物群落結構及其揮發性組分分析

高志遠，陳興杰，薛錫佳，鞏子路，鹿靜靜，潘天全，關玉權，程 偉

(安徽金種子酒業股份有限公司，安徽阜陽 236023)

中國白酒以大曲作為釀造的糖化、發酵、酒化和生香劑(如醬香、濃香、芝麻香、大曲清香、兼香等香型白酒)，大曲品質對白酒的產酒率及品質有著十分重要的影響[1-2]。當前，對大曲微生物種群結構、遺傳多樣性及系統發育地位進行了較多的分析，發掘出傳統技術不能培養的微生物菌群，并通過克隆測序等技術把優勢菌群鑒定到種。大曲微生物結構對大曲風味及其原酒的風格和品質具有重要影響，研究大曲微生物結構及揮發性組分，對明確白酒風格特點具有重要意義。施思等[3]利用高通量測序對濃香型大曲貯藏階段的真菌多樣性進行分析，結果表明畢赤酵母屬、根霉屬和恒梗霉屬為貯藏階段的最終優勢菌群；梁辰等[4]利用MiSeq高通量測序剖析大曲成熟過程中原核微生物群落結構變化，結果表明，大曲貯存過程中原核微生物的代謝活動對風味物質的形成具有重要的影響。由于大曲中含有較多的色素與油脂，頂空固相微萃取（HS-SPME）作為大曲揮發性組分分析的前處理方法，可以有效減少底物及液態基質中干擾物質的影響。HS-SPME 與傳統萃取法相比具有樣品用量少、檢測時間短等特點，可避免樣品熱解所導致的檢測誤差。陳勇等[5]采用HS-SPME-GC-MS 聯用技術測定大曲中的揮發性組分，考察了萃取頭、萃取溫度、萃取時間、樣品用量以及萃取方式等的影響，提高了該技術對大曲揮發性組分的萃取效率。

當前，關于江淮地區濃香型大曲微生物群落和揮發性組分的研究逐漸增多，但對江淮地區濃香型大曲不同部位的微生物群落及其揮發性組分的對比研究還鮮有報道。本實驗以金種子濃香型大曲為樣品，以曲皮和曲心為研究對象，采用MiSeq 高通量測序技術進行微生物群落結果分析，運用HSSPME-GC-MS聯用技術進行揮發性組分分析。本研究可為濃香型大曲的微生物群落結構及其揮發性組分的關聯性評價、大曲質量標準及其完善等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗曲樣：新出房的優質濃香型大曲（培曲時間為28 d，培曲月份為春季的3—4 月），由安徽金種子酒業股份有限公司生態釀酒基地制曲車間提供。

試劑及耗材：2%濃度的瓊脂糖凝膠，膠回收試劑盒，由qiagen公司提供。

儀器設備：氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS，7890A+5975C，EI 源），安捷倫科技有限公司；57330-U 手動SPME 進樣器，50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；TGL-20M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；GeneAmp@9700 型聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCPO）儀，美國ABI 公司；QuantiFluor 型-ST 藍色熒光定量系統，美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣方法

從曲樣的不同區域（表層、內部）取樣，作為曲皮和曲心樣品（以下簡稱為FYS 和FYI）。分別采集2 份樣品，1 份在無菌環境下粉碎后保存于無菌袋中，置于-80 ℃備微生物群落分析；另1份粉碎后保存于普通樣品袋中，置于-4 ℃備GC-MS分析。

1.2.2 樣品的微生物群落分析

大曲微生物總DNA的提取：采用CTAB或SDS方法對樣品的基因組DNA 進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣本DNA置于離心管中，用無菌水稀釋至1 ng/μL。

PCR 擴增定量：以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用帶Barcode 的特異引物(Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer: New England Biolabs)和高效高保真酶進行PCR 擴增，確保擴增效率和準確性。引物對應區域：16S V4區引物（515F 和806R）鑒定細菌多樣性；ITS1 區引物（ITS5-1737F和ITS2-2043R）鑒定真菌多樣性。

PCR 產物的混樣和純化：使用2%濃度的瓊脂糖凝膠對PCR 產物進行電泳，對檢測合格的PCR產物進行磁珠純化；采用酶標定量，根據PCR 產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物檢測，對目的條帶使用膠回收試劑盒回收產物。

文庫構建和上機測試：使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit 和Q-PCR 定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000 進行上機測序。建庫與測序等工作在蘇州帕諾米克生物科技有限公司完成。

1.2.3 樣品的HS-SPME-GC-MS揮發性組分分析

HS-SPME 方法：參考Ding 等[6]的方法，稱取1.00 g 大曲樣品放入頂空瓶中，再加入20 μL 2-辛醇甲醇溶液（內標終濃度為40.64 μg/g），蓋上瓶蓋；取50/30 μm DVB/CAR/ PDMS 萃取頭，在磁力攪拌器上插入加有20 μL 2-辛醇甲醇溶液和1.00 g大曲的頂空瓶，萃取溫度60 ℃，平衡10 min 后頂空吸附35 min，再插入溫度為250 ℃的氣質聯用儀解吸5 min后進行檢測。

氣相色譜與質譜條件：氦氣作為載氣，流速控制為1 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃，維持3 min，以5 ℃/min 升至80 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，維持8 min；氣化室溫度為250 ℃；不分流。質譜條件：選擇電子轟擊電離離子源（EI），電子能為70 eV，離子源溫度為230 ℃，質量范圍控制在40～400 u。

GC-MS 數據分析：各揮發性組分經NIST 數據庫譜庫檢索，結合相關文獻解析譜圖，選擇匹配度＞800 的鑒定結果以確定揮發性組分的種類，進行定性分析；以2-辛醇甲醇作為內標，將各揮發性組分的峰面積除以所有測得揮發性組分峰面積的總和，與內標的質量濃度作比，進行半定量分析。C(μg/kg)=Ac/Ais·Cis(μg/kg)；C：待測揮發性組分的質量濃度；Cis：內標物質的質量濃度；Ac：待測揮發性組分的峰面積；Ais：內標物質的峰面積。

2 結果與分析

2.1 大曲微生物多樣性指數分析

應用Illumian Mi Seq 高通量測序技術對金種子濃香型大曲的曲皮與曲心中細菌和真菌的多樣性進行分析，其16S rRNA 與ITS 測序結果及多樣性指數如表1 所示。Observed species 指數和Chao1指數能估算樣品中含有的物種數目（即OTU 數目），均能反映樣品的物種豐度。Shannon指數可以反應樣品中物種的分類總數及其占比，Simpson 指數用來表征樣品中群落內物種分布的多樣性和均勻度，均能反映樣品中物種的豐富度、均勻度和物種多樣性[7]。

由表1 的測序結果及多樣性指數可知，FYS 和FYI 樣品中分別產生75510 和82834 條真菌序列，根據97 %相似性歸類分別得到253 個和240 個OTU分類；FYS樣品的Observed Species 指數、Shannon 指數、Simpson 和Chao 1 指數分別為253、2.389、0.594 和266.684，表明樣品真菌群落的豐富度和多樣性較高。由表1 可知，FYS 和FYI 樣品中分別產生78226 條和78880 條細菌序列，根據97%相似性歸類分別得到340 個和342 個OTU 分類。綜上可知，不同樣品的Observed Species指數、Shannon 指數、Simpson 和Chao 1 指數表明樣品細菌群落的豐富度和多樣性均高于真菌。

表1 金種子濃香型大曲真核微生物的測序結果及多樣性指數

由圖1（a）可知，FYS 和FYI 的真菌OTU 分別為253 個和240 個，共有OTU 為141 個；共有OTU占FYI 總真菌OTU 的58.75%，共有OTU 占FYS 總真菌OTU 的55.73 %，綜上可知，FYS 的真菌多樣性高于FYI。由1（b）可知，FYS 和FYI 的細菌OTU分別為340 個和342 個，共有OTU 為221 個；共有OTU 占FYI 總細菌OTU 的64.62 %，共有OTU 占FYS 總細菌OTU 的65.00%，綜上可知，FYI 的細菌多樣性高于FYS。

圖1 基于屬水平金種子濃香型大曲的曲皮和曲心中OTU水平Venn圖

2.2 基于屬水平的金種子大曲微生物分布情況分析

如圖2（a）所示，FYS 中有2 個真菌屬的相對豐度大于10%，分別為Rhizopus（根霉菌屬，62.77%）和Saccharomycopsis（扣囊復膜孢酵母屬，17.10%），Rhizopus屬于優勢真菌菌屬；FYS 中相對豐度大于1.00 %的菌屬有Blumeria（布氏白粉菌屬，9.12 %）、Wickerhamomyces（異常威克漢姆酵母，1.09 %）、Aspergillus（曲霉屬，1.04 %）和Eurotium（冠突散囊菌菌屬，1.01%）。FYI中有2個真菌屬的相對豐度大于10%，分別為Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，44.89 %）和Thermomyces（嗜熱菌屬，44.61%）；FYI 中相對豐度大于1.00%的菌屬有Eurotium（冠突散囊菌菌屬，1.59%）、Rhizopus（根霉菌屬，1.23 %）、Rhizomucor（根毛霉菌屬，1.41 %）和Wickerhamomyces（異常威克漢姆酵母，1.36%）。

圖2 基于屬水平的金種子濃香型大曲的微生物相對豐度柱狀圖

金種子濃香型大曲屬于中高溫大曲，其培養的頂火溫度通常不高于60 ℃，較適宜于大部分真核微生物的生；因此，FYS 中Rhizopus占絕對優勢。Thermomyces是一種嗜熱的絲狀真菌，其最適生長溫度在50 ℃左右，因此，FYI 中Thermomyces占絕對優勢。SINGH S 等[8]的研究表明，Thermomyces可高效表達半纖維素酶，將釀酒原料細胞壁成分的半纖維素水解成寡糖，為酵母、細菌等釀酒微生物提供能量來源；李靜心等[9]的研究表明酵母菌是構成中高溫大曲的主要真菌，中高溫大曲中霉菌含量僅有1/4 左右，該研究結論與金種子濃香型大曲的真菌構成相似。

如圖2（b）所示，FYS 中有6 個細菌屬的相對豐度大于1.00 %，分別為Weissella（魏斯氏菌屬，31.84%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬，6.23%）、Li-mosilactobacillus（乳桿菌屬，2.78 %）、Kroppenstedtia（克羅彭斯泰蒂亞，1.64 %）、Pantoea（泛菌屬，1.50 %）、Saccharopolyspora（糖多孢菌，1.38 %），Weissella屬于優勢細菌菌屬。FYI 中有6 個細菌屬的相對豐度大于1.00 %，分別為Pantoea（泛菌屬，40.19 %）、Erwinia（歐文氏菌屬，18.20 %）、Saccharopolyspora（糖多孢菌，7.56%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬，3.31 %）、Kroppenstedtia（克羅彭斯泰蒂亞，2.01%）、Weissella（魏斯氏菌屬，1.69%），其中，Pantoea屬于優勢細菌菌屬。

本實驗表明金種子濃香型大曲的曲皮中乳桿菌目（主要為魏斯氏菌屬Weissella、乳桿菌屬Lactobacillus和片球菌屬Pediococcus）為優勢細菌，其豐度大于31.84%，在白酒固態發酵過程中，乳酸菌具有維護與保持釀酒微生態環境的作用，乳酸作為乳酸菌的主要代謝產物是形成乳酸乙酯等香氣成分的物質基礎。有研究表明[10]，大曲發酵過程中乳桿菌目（主要為魏斯氏菌屬Weissella、乳桿菌屬Lactobacillus和片球菌屬Pediococcus）、毛霉菌目（主要為橫梗霉屬Lichtheimia）和散囊菌目（主要為曲霉屬Aspergillus、Rasamsonia和絲衣霉屬Byssochla-mys）先后成為主要功能微生物類群，它們相繼承擔了一系列裂解酶和風味前體化合物的代謝任務。雷振河等[11]應用高通量測序技術對清香型白酒釀造用大曲和酒醅中微生物構成進行了分析，結果表明，大曲中優勢真核微生物主要包括曲霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、根霉菌屬、嗜熱真菌屬、假絲酵母屬，本實驗金種子濃香型大曲中的根霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、扣囊復膜孢酵母屬等與雷振河等人的研究結果相似，存在一定的差異性可能是由于制曲環境、原料及工藝等因素造成的。

2.3 大曲的HS-SPME-GC-MS揮發性組分分析

目前，大曲的質量判斷標準主要包括理化檢測和感官評價，感官評價主要依據大曲的外觀、斷面、菌絲以及聞香等方面。聞香是對大曲揮發性組分所表現出來的綜合香氣進行的感官評價，大曲揮發性組分對大曲的香氣具有重要作用，同時大曲揮發性組分是白酒香氣的主要來源和前體物質，因此，研究大曲揮發性組分對大曲的質量評價及原酒的品質穩定都具有重要意義。陳蒙恩等[12]利用HSSPME-GC-MS 技術從陶融型大曲中檢測出7 大類45種揮發性成分，并解析了大曲微生物群落結構及揮發性物質組成。由表2 所示FYS 中揮發性組分的分析結果可知，FYS 中共檢出了27 種揮發性組分，分別為4 種酸類、1 種醛類、9 種酯類、2 種呋喃類、5 種含氮化合物、6 種芳香族化合物。酯類化合物通常具有令人愉悅的水果樣芬芳香氣，在大曲樣品中檢測到多種酯類物質，對白酒特殊風味和品格的形成具有重要作用[13]。

表2 HS-SPME-GC-MS分析鑒定FYS中揮發性組分的分析結果

由表3 可知，FYS 中共檢出27 種揮發性組分，分別為2 種酮類、1 種烯烴、2 種酸類、2 種醇類、9 種酯類、2 種呋喃類、4 種含氮化合物、5 種芳香族化合物。對比表明，FYS 和FYI 中均檢測到9 種酯類，FYI 中的風味組分比FYS 多2 種酮類、1 種烯烴，少2 種酸類。在FYI 中檢測到3 種吡嗪類物質，其中4-甲基吡嗪的含量達到1.86 μg/g。吡嗪類化合物通常具有強烈的堅果、焙烤、咖啡、焦香等香氣特征，閾值極低，對酒體風味具有正向貢獻，2,5-二甲基-吡嗪具有刺鼻的炒花生香氣和巧克力、奶油香氣，2,6-二甲基吡嗪具有咖啡和炒花生的香氣，4-甲基吡嗪具有特殊的堅果香氣，4-甲基吡嗪具有擴張血管、改善微循環及抑制血小板積聚，保肝、護肝以及抑制腫瘤的功效[14]。通過加熱發生的美拉德反應是食品制作過程中產生吡嗪類化合物的重要途經，某些耐高溫細菌的生長代謝過程也產生吡嗪類物質。濃香型大曲培曲過程中曲心的溫度普遍高于曲皮的溫度，這可能是曲心中生成吡嗪類化合物的重要原因。綜上可知，曲心中檢測到的3 種吡嗪類化合物可作為曲心區別于曲皮的特殊組分。

表3 HS-SPME-GC-MS分析鑒定曲心揮發性組分的分析結果

本實驗從曲皮與曲心樣品中均檢測到不同類別的醛酮類揮發性組分，醛酮類物質主要通過大曲微生物降解原料中的淀粉以及在糖酵解過程中產生，尤其是在酵母作用下的糖酵解[15]。大曲中的醛酮類物質和酯類物質是大曲獨特香氣的重要構成組分，并且醛酮類物質作為微生物代謝的前體物質在發酵過程中對白酒特殊香氣的形成具有重要作用。樣品中檢測到不同類別的芳香族化合物是賦予大曲豐富且復雜香氣的特殊化合物，主要包括具有典型花草香氣的苯甲醇和苯乙醇，具有典型墨水氣味的萘和苯酚，具有適當甜味的甲苯和乙基苯，以及具有苦杏仁味的苯甲醛（安息香醛）[16]。

3 討論與結論

對白酒釀造過程中制曲與釀酒的微生物多樣性進行分析，結合代謝組學原理研究白酒風味物質，以探究釀造工藝的微生物代謝途徑及機制、剖析其微生態作用過程、找到相關功能菌株等，對提高白酒品質、原料利用率和出酒率、特征風味成分的得率等具有重要意義。釀酒大曲質量標準的建立，需要綜合感官指標、微生物指標以及理化指標等因素，揮發性風味組分作為大曲的重要理化指標，可以作為大曲質量標準建立過程中的重要依據。

本實驗以金種子濃香型大曲為樣品，以曲皮和曲心為研究對象，采用高通量測序技術和HSSPME-GC-MS技術對不同樣品進行微生物群落結構及揮發性風味組分特征對比分析，得到的結論主要有：(1)曲皮中的優勢真菌屬為Rhizopus（根霉菌屬，62.77 %），優勢細菌屬為Weissella（魏斯氏菌屬，31.84 %）；(2)曲心中的優勢真菌屬為Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，44.90 %）和Thermomyces（嗜熱菌屬，44.61%），優勢細菌屬為Pantoea（泛菌屬，40.19 %）；(3)曲皮和曲心中均定量檢測出27 種揮發性組分，分別為酸類、醛類、酯類、呋喃類、含氮化合物和芳香族化合物等，在對應樣品中的種類和含量存在差異；(4)曲心中檢測到的3 種吡嗪類化合物可作為曲心區別于曲皮的特殊組分。本研究可為濃香型大曲的微生物群落結構及其關聯性評價、大曲質量標準及其完善等提供參考。