五種青皮核桃酒的抗氧化活性分析研究

安 睿，Davide Fornacca，李政強，佘 容，3，4，楊曉燕，3，4

（1.大理大學天然抗氧劑與抗氧化炎癥研究院，云南大理 671003；2.大理大學東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；3.大理大學三江并流區域生物多樣性保護與利用云南省創新團隊，云南大理 671003；4.中國三江并流區域生物多樣性協同創新中心，云南大理 671003）

氧化應激（Oxidative Stress，OS）指機體在發生各種生化反應過程中，細胞自發產生氧自由基，以及隨后由氧自由基（ROS）引發一系列從細胞到全身的生理學和病理學反應過程[1]。ROS 的產生無法避免且會引起機體早期動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓、病理性肥胖與相關并發癥[2-4]。抗氧化劑是可清除活性氧（ROS）及其前體，參與修復細胞損傷的化合物[5-6]，對預防某些慢性疾病如心血管疾病、神經系統疾病或炎癥具有潛在的作用[7-8]。因此，人們對富含抗氧化劑的食物產生了濃厚的興趣。

核桃（Juglans regiaL）是世界上最古老的人類種植的樹生干果之一[9]，深受消費者喜愛。云南不僅核桃種植面積位居全國之首[10]，所產核桃也因高海拔種植的特點而具有極高的營養成分[11]，被譽為世界核桃家族中的上品[12]。云南核桃產業更是成為云南省推進發展高原特色現代農業和打造世界一流“綠色食品牌”的重點項目之一[13]。目前云南核桃的經濟價值體現形式相對單一，主要以直接售賣核桃堅果為主，在深加工方面也僅局限于核桃飲料和核桃油[14]，鮮見其他深加工的報道。近年來，隨著種植面積的擴大，產量的提高，核桃的經濟價值急劇下滑，嚴重影響種植戶的經濟收入，甚至已有種植戶計劃移除核桃植株，改種其他作物。在此背景下，積極開發核桃的其他經濟價值迫在眉睫。研究表明，核桃較其他堅果具有更強的抗氧化能力[15-16]，核桃青皮最近也被證明具有較強的抗氧化活性[17]。但是核桃青皮不能直接食用[18]，其有效成分的利用需借助一定的加工手段轉化。泡酒是中國酒類傳統加工工藝，能有效提取浸泡材料中的養生、保健成分，很多中醫藥方均采用以酒治病，歷史已不下百年[19]。核桃的抗氧化能力主要源于酚類化合物[20]，酒中所含的乙醇是一種良好的酚類物質萃取劑，能使核桃青皮里的抗氧化物質被充分溶解[21]，因此，泡酒可以作為核桃的開發途徑。

本研究以云南省的硬核期青皮核桃為主要原材料，參照歐洲核桃酒的制作工藝[22]釀造核桃酒，并對所得核桃酒進行ABTS 自由基清除能力、FRAP 總氧化還原能力和羥自由基清除能力的測定，評估核桃泡酒的抗氧化能力，為核桃產業經濟轉化探索更多有價值的可行途徑，為核桃產業的可持續發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 核桃酒的制備

參照歐洲核桃酒釀造配方，并進行適當調整，具體如表1所示。

表1 核桃酒的配料表

按照配比，將取自云南的青皮核桃對半切，與其他配料一起放至提前備好的大麥酒中，密封，標記，置陽光下保存4 周，4 周后，用無菌紗布將配料從酒中過濾出來，核桃酒放置黑暗處儲存，備用。未添加配料的純大麥酒為對照。

1.1.2 試劑及耗材

ABTS 試劑：以ABTS(7 mmol/L)+K2S2O8（4.9 mmol/L，過硫酸鉀）按1∶1 的體積比混合，避光儲存12～16 h 后，用無水乙醇稀釋，搖勻，靜置5 min，734 nm 處測吸光度為0.7（±0.02），即得ABTS工作液。

FRAP 試劑：0.3 mol/L 醋酸緩沖液（pH3.6），稱取0.364 g 無水醋酸鈉，加入3.2 mL 冰乙酸，用RO水定容至200 mL，1 mol/L HCL調節pH3.6。

10 mmol/L TPTZ 溶液：稱取0.078 g TPTZ，用40 mm 鹽酸溶液稀釋定容至25 mL。將上述3 種溶液依次以10∶1∶1的比例混合即得（現配現用）。

1.1.3 儀器設備

艾柯實驗室超純水機（AKDL-II-24），成都艾柯水處理設備有限公司；超聲波清洗機（SB25-12DTD），寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS-26），上海-恒科學儀器有限公司；可見光分光光度計（722N），上海菁華科技儀器有限公司；比色皿（751/722 型），天錫新竹光學儀器有限公司；電子天平（PX224ZH），奧豪斯儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 ABTS自由基清除能力測定

ABTS 自由基清除率的測定參照文獻[23]進行，用無水乙醇（水提取物用水）將樣品提取物配置成不同濃度，備用。

量取Vit C 母液，用無水乙醇梯度稀釋成與樣品相同的濃度備用。將不同濃度的樣品和Vit C 分別與ABTS 工作液各2 mL 混勻，每組六個平行，一個對照。避光反應6 min，立刻吸取混勻的液體至比色皿中，用溶劑調零，于734 nm 處測定各管吸光度值并記錄。計算ABTS自由基清除率：

ABTS自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：Ai為樣品溶液反應吸光度；Aj為樣品溶液加入無水乙醇（水提取物用水）的吸光度；A0為甲醇代替樣品反應吸光度。

1.2.2 FRAP總還原能力測定

FRAP 總還原能力的測定參照文獻[24]進行，用無水乙醇（水提取物用水）將樣品提取物配制成不同濃度，備用。取不同濃度的樣品與FRAP 工作液各2 mL，混勻，37 ℃水浴10 min，于593 nm 處測定吸光度值。每組設六個平行，一個空白對照。

標準曲線繪制：用去離子水配制FeSO4溶液（濃度梯度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.6 mmol/L），按照上述方法測定系列標準溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，FeSO4濃度為橫坐標繪制標準曲線。

樣本總氧化還原能力計算：以1.0 mmol/L Fe-SO4為標準，樣品氧化還原能力以達到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數表示，計算公式如下：

式中：A1為樣品管的吸光度；A2為空白對照管的吸光度；A0為1 mmol/L FeSO4標準溶液吸光度。

1.2.3 羥自由基清除能力測定

樣品管：取2 mL 不同濃度的樣品，分別加入6 mmol/L FeSO4與6 mmol/L H2O2工作液各2 mL，混勻，靜置10 min，再加入2 mL 的6 mmol/L 水楊酸，混勻放置30 min，并于510 nm 處測定吸光度值。每組設六個平行。

對照管：取2 mL 不同濃度的樣品，分別加入6 mmol/L FeSO4與6 mmol/L H2O2工作液各2 mL，混勻，靜置10 min，再加入2 mL 的去離子水（RO水），混勻放置30 min，并于510 nm 處測定吸光度值并記錄。

計算羥自由基清除率：

式中：Ai為樣品溶液反應吸光度；Aj為樣品對照溶液的吸光度；A0為去離子水代替樣品反應吸光度。

1.2.4 數據處理

半抑制量（IC50）：根據提取物羥自由基/ABTS自由基清除率與濃度曲線所得回歸方程，計算得到5 種核桃酒將自由基原始質量濃度減少至50 %時的使用濃度（IC50）。

比活性：即提取物與Vit C IC50的比值。比活性越大，代表其自由基清除能力越強。

同時，采用Origin pro 2021 軟件繪制提取物濃度與抗氧化活性關系圖；SPSS 20.0 軟件計算不同提取物的IC50值；使用Omic Share 云分析工具（https://www.omicshare.com）對不同種類核桃酒的IC50值進行多組檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 ABTS自由基清除能力

2.1.1 樣品ABTS自由基清除能力

大麥酒對ABTS 自由基的清除能力最高僅為15.27%。

5 種核桃酒對ABTS 自由基清除率除核桃酒2、核桃酒4 外，其余均隨著樣品稀釋倍數的升高而降低，且形成較良好的線性關系。因曲線擬合較為復雜，難以判斷5 種核桃酒對ABTS 自由基清除能力的強弱（圖1）。

圖1 核桃酒對ABTS自由基的清除活性

2.1.2 核桃酒ABTS 自由基清除率IC50多組檢驗分析

根據不同樣本IC50值可發現，5 種核桃酒的總氧化還原能力的強弱依次為：核桃酒2＞核桃酒4＞核桃酒1＞核桃酒5＞核桃酒3。統計分析結果顯示，核桃酒1、核桃酒2、核桃酒4、核桃酒5 的ABTS 自由基清除能力無顯著差異，但核桃酒2 與核桃酒3具有顯著差異（P＜0.01）（圖2）。

圖2 ABTS自由基清除率IC50多組檢驗分析

2.2 總氧化還原能力

2.2.1 FRAP標準曲線

標準曲線顯示，FeSO4的濃度范圍在0.1～1.6 mmol/L 時，吸光度隨著FeSO4濃度的增加而增加，呈現較好的線性關系(y=0.6012x+0.0429，R2=0.9937)，見圖3。

圖3 FRAP實驗的標準曲線

2.2.2 樣品總氧化還原能力

大麥酒的總氧化還原能力最高為11.76，僅為核桃酒總氧化還原能力的一半。

5 種核桃酒在總氧化還原能力上無顯著差異，且呈良好的線性關系。5 種核桃酒均在稀釋150 倍后，還原能力趨于穩定。僅基于擬合曲線難以判斷5種核桃酒總氧化還原能力的強弱，見圖4。

圖4 核桃酒FRAP總氧化還原能力

2.2.3 核桃酒總氧化還原能力的多組檢驗分析

根據不同樣本IC50值可發現，5 種核桃酒的總氧化還原能力的強弱依次為：核桃酒1＞核桃酒4＞核桃酒5＞核桃酒2＞核桃酒3。統計分析顯示，核桃酒2、核桃酒3、核桃酒4、核桃酒5 的總氧化還原能力無顯著差異，但核桃酒1 顯著高于核桃酒2、核桃酒3（P＜0.05），見圖5。

圖5 總氧化還原能力的多組檢驗分析

2.3 樣本羥自由基清除能力

2.3.1 樣品羥自由基清除能力

大麥酒對羥自由基的清除能力最高為41.13%。

5 種核桃酒因曲線擬合較為聚集，難以判斷對羥自由基清除能力的強弱。但部分種類的核桃酒稀釋400 倍以上時，其清除自由基的能力明顯下降，見圖6。

圖6 核桃酒對羥自由基的清除活性

2.3.2 核桃酒羥自由基清除率測定的多組檢驗分析

對5 種核桃酒羥自由基清除率的IC50值進行比較可發現，5 種核桃酒對ABTS 自由基清除能力的強弱為：核桃酒1＞核桃酒4＞核桃酒2＞核桃酒5＞核桃酒3。統計分析結果顯示，核桃酒1、核桃酒2、核桃酒4、核桃酒5 的總氧化還原能力無顯著差異，但核桃酒3 與核桃酒1、核桃酒4 具有顯著差異（P＜0.05），見圖7。

圖7 羥自由基清除率測定的多組檢驗分析

3 討論

本實驗使用3 種不同方法對5 種核桃酒的體外抗氧化活性進行了評價，實驗結果顯示：添加了青皮核桃等配料的核桃酒，不僅相較于原料純大麥酒來說，具有更強的抗氧化能力，而且較核桃而言，也發揮出了更大的抗氧化活性[26]。5 種核桃酒之間存在抗氧化能力的強弱差異，其中核桃酒1 的FRAP還原能力與羥自由基清除能力最強，核桃酒2 的ABTS 自由基清除能力最強，核桃酒4 的所有指標均處第二位，核桃酒3 的所有指標整體評估較弱。核桃酒1、核桃酒2 與核桃酒3 配方相同，主要的差異是核桃酒1 和2 的青皮核桃含量比核桃酒3 高出50%，說明青皮核桃對總體抗氧化能力的評估起主要影響。

研究表明傳統香料也具有抗氧化活性[27]。在本研究中，核桃酒2與核桃酒1的青皮核桃含量一致，但核桃酒2 的香草、肉豆蔻的含量是核桃酒1 的50%，肉桂含量為70%，原則上來說，核桃酒2的抗氧化活性應低于1，但2 對ABTS 的自由基清除能力高于1，說明香料添加過度也許會抑制ABTS 自由基清除能力。

在本研究中，添加的糖類存在差異，這也會影響核桃酒的抗氧化能力。核桃酒4 的三個抗氧化指標，在5 組樣本中均排名第二，分析其配料發現，其青皮核桃含量低于2，輔料中，除糖類為冰糖，不同于2的白糖外，其他成分與核桃酒2接近，但是核桃酒4 的FRAP 還原能力與羥自由基清除能力高于2，這說明在提高核桃酒抗氧化活性方面，冰糖優于白糖。通過核桃酒4 與核桃酒5 的比較發現，核桃酒4 中青皮核桃的含量顯著低于核桃酒5，但核桃酒4 在各項指標評定中均優于核桃酒5，說明添加冰糖更有利于提升核桃泡酒的抗氧化能力，具體原因有待分析。

綜上所述，以青皮核桃為主料制作的核桃酒具有抗氧化能力，可以作為核桃產業的附加產品進一步開發利用。但是因添加青皮核桃的量以及輔料種類與含量的不同，其抗氧化活性存在顯著差異，未來應進一步在保證核桃酒風味的前提下，調整優化主輔料配方，發揮出核桃最大的利用價值。