白酒中四甲基吡嗪形成機制及相關應用的研究進展

孫玉婷，鄭曉衛，，葉 力，陳玉紅，楊 鑫，劉沛通，丁子元

(1.中糧營養健康研究院有限公司，北京 102209；2.酒鬼酒股份有限公司，湖南吉首 416099)

中國白酒歷史悠久，以糧谷類為主要原料，以大曲、小曲或者麩曲為糖化發酵劑，采用固態、半固態或者液態的發酵方式，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾、老陳、勾調等過程制成[1]。中國白酒由于其生產所在的自然環境差異、釀造原料差異、糖化發酵劑差異、生產工藝差異和餾酒差異，風格各具特色。

隨著“健康中國”戰略的制定與實施，消費者對于白酒健康層面的需求也愈加明顯。食品安全與飲食健康成為熱議話題[2]，健康飲酒被提升至新的高度。據統計，2015—2019年白酒消費趨勢向名優產品轉變，白酒產業正在向高質量發展穩步推進，研究內容也向白酒健康價值等方向傾斜。

已知白酒中的功能因子包含酸類、醇類、酚類、酯類、醛酮類、活性肽、氨基酸、多糖和吡嗪類等，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降脂、降血壓、鎮痛、抑菌、降血糖，預防心腦血管疾病、精神系統疾病等功效[3]，如亞麻酸、γ-氨基丁酸、洛伐他汀等成分早已在行業開展研究。

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪[4]，易溶于醇，微溶于水，近年來受到行業內廣泛關注。其對白酒醬香風味的形成有重要貢獻，同時也是行業公認的“健康因子”，具有擴張血管、輕度降壓、防止血小板凝集與血栓形成、抑制纖維細胞增生、調節脂質代謝、提升免疫水平、利尿、護肝、體外抗炎等諸多功效[5-6]。本文綜述了TTMP 在白酒中的研究進展，旨在為后續學者進一步研究提供參考。

1 TTMP在白酒中的研究進展

早在20 世紀80 年代，在白酒風味物質解析時發現了TTMP 的存在，2005 年，莊名揚提出通過美拉德反應生成吡嗪等雜環化合物有助于白酒風味的形成[7]，2006 年吳建峰提出TTMP 是白酒中的主要功能性成分之一，在不同香型白酒中普遍存在，引起行業關注[5-6]，2012 年徐巖團隊[8]依托“中國白酒169 計劃”分析檢測到茅臺酒中有重要風味貢獻度的物質中TTMP 等吡嗪類化合物有較高濃度，為白酒“健康因子”概念的引入奠定基礎。

隨著人們對健康關注度的提高和日常檢驗分析技術的提升，近年來TTMP 在白酒領域的研究熱度逐漸升溫，熱點集中于探究白酒發酵過程中TTMP 的生成方式和重要積累環節，高產TTMP 功能菌株的分離、篩選及強化應用，利用多種檢測手段對白酒生產過程與成品酒中的TTMP 進行定性與定量分析等[9]。

1.1 白酒釀造過程中TTMP的生成和積累

1.1.1 TTMP的生成方式

早期學者對于TTMP 在白酒發酵過程中的生成方式普遍認為有兩種路徑：葡萄糖和氨基酸在高溫作用下通過美拉德反應生成；微生物引發糖降解產生丙酮酸，兩分子的丙酮酸縮合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脫羧產生乙偶姻，發酵體系中的乙偶姻和氨基酸在相關酶的催化作用下生成TTMP[8，10]。隨著研究的深入，通過第二種路徑生成TTMP的結論被不斷證實。

吳建峰[6]于2013 年發現并證明在固態發酵條件下，功能菌株枯草芽孢桿菌S12 代謝產生3-羥基丁酮（又名：乙偶姻），同時S12 分泌蛋白酶將蛋白質降解為氨基酸，氨基酸脫氫得到氨，3-羥基丁酮和氨通過縮合作用合成TTMP，且高溫有利于此縮合反應的發生。

張溫清[9]基于功能菌株強化接種與TTMP 產生情況，證實糟醅中TTMP 含量與溫度和功能菌株豐度呈正相關，釀酒過程中TTMP 是由釀造微生物通過生物途徑代謝產生，并且高溫對其形成有促進作用，進一步證實固態發酵條件下的TTMP 生成方式并非傳統認為的美拉德反應，而是生物反應。

侯孝元[11]總結了前人對于TTMP 的合成路徑研究經驗，總結出提高微生物發酵生成TTMP 的兩種方法：一是獲得優良菌株，提高前體乙偶姻的積累量；二是向發酵液中添加銨鹽提高乙偶姻轉化率和四甲基吡嗪的產率。

綜上所述，TTMP 的生物代謝途徑為通過性能優良菌株獲得TTMP的前體物質3-羥基丁酮，3-羥基丁酮與氨在高溫作用下發生縮合反應生成TTMP，氨的來源包括外部環境添加、底物中蛋白質降解脫氫等。

1.1.2 TTMP的重要產生環節

白酒釀造過程涉及制曲、發酵、蒸餾等多個環節，不同企業在發展過程中摸索形成了自身獨具特色的釀造工藝，加之地域差異導致的菌群差異，從而形成國內十二大白酒香型。基于目前的研究報道，醬香型和芝麻香型白酒中吡嗪類物質的含量相較于其他香型白酒是最高的，與其生產工藝密切相關[12]。醬香型白酒和芝麻香型白酒釀造工藝都具有高氮原料、高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵以及高溫餾酒的特點。這與上述吳建峰與張溫清提出的高溫對TTMP 形成有促進作用的結論相印證。同時二位學者以芝麻香型白酒酒曲、酒醅和基酒等為研究對象，對TTMP 的積累環節進一步驗證，得到多糧曲高于小麥純糧曲，高溫曲（頂溫近67 ℃）高于中溫曲（頂溫50～55 ℃），細菌曲高于真菌曲的結論，吡嗪類物質在堆積后含量增加，高溫發酵和高溫蒸餾也有利于TTMP 形成，原酒儲存中不產生TTMP[6，9]。

圖1 基于酶與熱力學耦連的TTMP合成路徑圖

相較小麥純糧曲，多糧曲中增加了高含蛋白的豌豆、大麥等原料，為TTMP 的形成提供了更多必要的氮類前體物質。高產TTMP 前體物質3-羥基丁酮的優良菌株主要為細菌而非真菌，高溫是縮合反應生成TTMP 的必要條件。TTMP 在釀酒過程中的重要產生環節包括高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵等。

1.2 TTMP功能菌株分離、篩選及強化應用

1.2.1 功能菌株的分離與篩選

與上述TTMP 的主要產生環節相關聯，野生型功能菌株的主要來源為高溫大曲和高溫堆積料等，已報道的功能菌株主要集中在芽孢桿菌屬（Bacillus），包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）等，也與上述細菌曲高于真菌曲的實驗結論相印證[6，9]。功能菌株的分離多依賴傳統培養方式，以基于感官評價的產醬香能力[13]或基于生化反應（V-P 實驗）的產乙偶姻（TTMP 前體物質）能力作為篩選指標[14]，也有學者將產蛋白酶能力與產乙偶姻能力作為雙篩指標[9]，以獲得功能菌株。V-P 實驗基本原理為乙偶姻在強堿環境下，氧化為雙乙酰，雙乙酰與胍基反應生成紅色化合物，甲萘酚的存在可以促進并加速紅色物質生成，于500～600 nm 范圍內有光吸收，吸光度在一定范圍內與乙偶姻濃度呈正相關，基于此原理，學者們開發了平板篩選、高通量篩選等方法。

野生型菌株生產TTMP 產量低的問題普遍存在，學者們采用誘變育種、基因工程等手段對產TTMP菌株進行改造與調控，以期獲得高產菌株。許平等[15]采用亞甲基胍誘變方式對出發菌株做誘變篩選，以期提高誘變菌株產TTMP 能力；郭維偉[16]對從景芝芝麻香白酒高溫大曲中分離的野生地衣芽孢桿菌進行等離子誘變，篩選獲得高產突變株，發酵液產量達到20.24 g/L，比原始菌株提高了72.67%，遺傳性狀穩定；黃曉潤[17]對枯草芽孢桿菌產醬香相關基因進行篩選與功能研究，鎖定得出3個產醬香候選基因cdo A（半胱氨酸雙加氧酶）、pan E（酮泛解酸還原酶）、lsp A（脂蛋白信號肽酶Ⅱ），并證實3 個基因最終作用于丙酮酸途徑，從而影響四甲基吡嗪合成；Wu 等[18]通過敲除枯草芽孢桿菌BS2 中的bdh A（2,3-丁二醇脫氫酶）基因，增加乙偶姻的積累從而增加發酵終產物中的TTMP產量，為從基因層面實現產物表達調控提出了研究思路。

圖2 V-P實驗反應

1.2.2 功能菌株的強化應用

白酒釀造過程中功能菌株的強化應用場景多發生于TTMP 的主要產生環節，包括制曲、堆積和發酵等。

1.2.2.1 強化制曲

強化制曲分為強化麩曲與強化大曲兩個工藝方向，強化麩曲的研究與應用最為多見。強化麩曲的應用場景之一是在傳統釀造工藝的基礎上，引入強化麩曲或改良麩曲以實現酒體風味的改變與提升，如張溫清[9]對芝麻香麩曲原料配比、酸堿度、含水量和接種量等因素進行工藝優化，獲得的功能麩曲中TTMP 含量達607.58 mg/kg，以丟糟作為功能麩曲原料之一進一步優化制備工藝，TTMP 產量達1.28×103mg/kg，為目前報道的最高水平；葛向陽等[19]將接有功能菌株的大曲應用到釀造環節以探索濃香型白酒高產TTMP 的釀造工藝，結果表明，60%的功能曲與40%的大曲結合可以使濃香型原酒TTMP 含量提高到3～6 mg/L，是原始工藝的5～20 倍；李曉霞[20]從汾酒大曲中分離獲得高產TTMP菌株，制備成固態菌劑后，在不干擾正常的釀酒生產下，以1 %添加量同大曲一并加至酒醅中，進行入缸發酵，結果表明TTMP 含量增加到5.3 μg/mL，為對照組的3倍。

1.2.2.2 強化發酵

強化發酵包括強化堆積發酵與強化入池發酵兩個方向。王西等[21]將從高溫大曲中篩選得到的枯草芽孢桿菌分別接種到醬香型二次酒高溫堆積前和入池前的糟醅中，模擬醬香型白酒生產完成堆積與入池發酵過程，“堆積組”發酵后的TTMP 含量是“空白組”的3.08 倍，“入池組”發酵后的TTMP 含量是“空白組”的2倍。王曉丹等[22]將從高溫大曲中分離得到的地衣芽孢桿菌添加到粹沙酒窖池中層的糟醅中，發酵后TTMP含量是對照組的3.03倍。

1.2.2.3 多環節強化工藝結合

除上述單一強化手段外，學者們也將功能菌株強化應用于白酒釀造的多個環節中，或在原有工藝基礎上改良多個環節。艾金鐘等[23]在紅星二鍋頭原有工藝基礎上，增加高溫堆積環節，將蛋白酶活性較高的芽孢桿菌制備為功能麩曲，聯合高溫大曲共同用于堆積發酵，在原酒風格基本不變的情況下，TTMP 含量由原工藝的0.03 mg/L 提高至約10 mg/L；馬美榮等[24]從北京紅星（清香型）大曲中分離獲得高產TTMP 芽孢桿菌用于麩曲制作，結合高溫堆積發酵過程用于清香型白酒生產，原酒風格整體不變，TTMP 含量由傳統工藝的0.11 mg/L 提升至10 mg/L 以上；盧君[25]將功能菌株制備為固體菌劑，分別通過在入池發酵前進行強化接種、將菌劑加入尾酒中用于酒糟串蒸以及將上述兩種方法相結合的方式進行工藝優化，醬香型白酒基酒中TTMP 的含量分別提高160.71%、85.75%和202.75%。

盡管功能菌株的強化應用研究如火如荼，但大家的關注點普遍在于基酒中四甲基吡嗪含量的變化，對于強化應用后整體酒質風味、風格的改變，發酵過程中強化菌株對于原始菌群的擾動情況并未做深入分析，行業也暫無實際強化應用的案例，可見對于功能菌株的應用仍需建立在對發酵機理研究更為透徹的基礎之上。

2 TTMP的檢測

2016 年國家發布了GB 1886.295—2016《食品添加劑2,3,5,6-四甲基吡嗪》，該方法適用于由2,3-丁二胺和丁二酮，或者由乙偶姻和銨鹽制備而得的食品添加劑TTMP，此國標方法的檢測對象為高純度TTMP。白酒在釀造過程中發酵底物復雜，狀態多樣，代謝化合物種類繁多，TTMP 作為白酒中的微量組分，對檢測方法的適用性和準確度提出挑戰。目前，白酒中TTMP 的分析步驟涉及萃取和檢測過程。

2.1 萃取方法

白酒過程樣品及成品酒樣中TTMP 的常見萃取方法包括液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、液液微萃取（LLME）、固相微萃取（SPME）和頂空固相微萃取（HS-SPME）等[26]，不同提取方法有各自的優缺點。

在此基礎上學者們也對提取方法做了進一步優化，如孫嘯濤等[26]建立了渦旋輔助液液微萃取技術，使待測化合物在樣品溶液及萃取劑之間1 min達到萃取平衡，具有高效、快速和低溶劑消耗的特點，實現了快速萃取技術的開發。

2.2 檢測方法

早期學者多使用液相色譜法（LC）[35-36]和氣相色譜法（GC）[34，37]完成白酒過程樣品及成品樣品中TTMP 的檢測，上述檢測方法操作簡單，精密度較高，對白酒廠的儀器設備條件要求不高，便于推廣。隨著檢測技術的提升與各種高端質譜的引進，氣質聯用技術（GC-MS）與液質聯用技術（LC-MS）在白酒行業興起，質譜聯用技術極大提高了檢測準確度，降低了目標物檢出的限量值。司冠儒等[38]基于芝麻香型白酒樣品對氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜質譜聯用法的重復性和精確度進行評估，發現上述技術均可以滿足白酒廠日常檢測分析的要求。基于日常檢測經驗，針對大曲、糟醅等TTMP 含量較低的復雜基質，液相色譜質譜聯用法檢出限更低，靈敏度更高，為后續學者開展檢測工作提供參考。

黃杰等[39]建立了白酒中TTMP 的氣相色譜-三重四級桿質譜（GC-QQQ）測定法，該法樣品預處理簡單，分離度高，測定低限0.2 mg/L，為定量測定白酒中TTMP 提供了一種有益探索；Zhu 等[40]使用全二維氣相色譜-飛行時間質譜（GC×GC-TOFMS）技術對茅臺中的重要風味物質進行定性與定量識別，有效識別出含氮類物質19 種，包括TTMP；王柏文等[28]應用氣相色譜-質譜（GC-MS）與氣相色譜-氮磷檢測器（GC-NPD）技術對國井芝麻香型白酒中含氮化合物進行分析，含氮化合物專用檢測器相較傳統質譜檢測器靈敏度更高，提高了白酒中含氮化合物檢測的精度。

表1 TTMP的常見萃取方法

3 結語

隨著國民生活水平的顯著提高，我國已經進入了消費者對美酒追求的時代，但白酒行業整體產能過剩，優質酒產能不足，成為優質白酒在消費市場供應的關鍵矛盾點，因此白酒產品勢必要向“風味與品質”雙導向轉變。

白酒中TTMP 的相關研究已經持續數十年，隨著健康因子概念的提出，更是成為行業研究熱點。但目前仍存在一些問題有待探討，如高產TTMP 菌株的強化接種操作對整個白酒釀造體系中繁雜的菌系、酶系和物系存在更多積極或消極的影響還未知，功能菌劑的實際應用仍屬于起步階段，TTMP在白酒領域的檢測方法仍沒有統一的標準等。

白酒中微量成分多種多樣，健康因子種類眾多，除文中提到的TTMP，還包括萜烯類、多元醇和生物活性肽等[3]，對于白酒中功能成分的研究將有助于消費者正確認識白酒，樹立白酒正確的消費觀和價值觀，真正實現“少喝酒，喝好酒”，“理性飲酒，健康消費”。