雙水相-GC-MS/MS測定醬香型白酒釀造過程揮發性酚類物質變化規律的研究

畢榮宇，盧 君，唐 平，山其木格，王 麗，王 凡，李長文

（1.貴州國臺酒業集團股份有限公司，貴州仁懷 564501；2.天士力控股集團有限公司研究院，天津 300410）

中國白酒釀造歷史悠久，作為十二大香型白酒之一的醬香型白酒因其獨特的風格越來越受到人們的喜愛，已融入到日常生活的各個領域[1-2]。醬香型白酒起源貴州，是以當地糯紅高粱為原料，小麥制作的高溫大曲作為糖化發酵劑，經蒸煮、發酵、蒸餾、貯存、勾兌等釀造工藝而制成的[3]。相關研究表明，小麥皮中含有0.5%的阿魏酸，在發酵過程中會生成4-甲基愈創木酚（4-Methylguaiacol，4-MG）、4-乙基愈創木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG）等酚類化合物。酚類化合物在醬香型白酒風味和口感上起著非常重要的作用[4-5]。相關研究認為，當4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP）和4-EG 的總量在酒中的濃度小于400 μg/L 時，會使酒產生辛香、煙氣和革香韻的風味，當總質量濃度大于620 μg/L時，會使酒產生明顯的酚類特征，產生腥異味，掩蓋酒的香味[6-11]。因此對白酒中揮發性酚類化合物進行定性定量檢測，監測其含量的變化，優化生產工藝，避免產生異雜味，就顯得尤為重要。

目前，酒樣中酚類化合物的前處理方法主要有直接進樣[12]、液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[13-14]、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）[15]、固相萃取（solid phase extraction，SPE）[8，16]、攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）[17]等。檢測方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、氣相色譜質譜法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）[18]等聯合上述前處理方法進行酚類化合物的分析研究。

對比不同酚類化合物的前處理方法，每種方法都有各自優點和不足[19]。本研究利用雙水相萃取的前處理方式，以白酒中的乙醇作為萃取劑，加入無機鹽進行分相，通過雙水相萃取法直接提取酚類化合物，結合氣相色譜質譜聯用技術測定白酒中的酚類化合物。該方法操作條件溫和、提取工藝簡單、易于連續操作、效率高、無毒無害、成本低[20-23]，適用于白酒企業對酚類化合物的定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：酒樣（JT、LT、GT、DT、XT、MT、ZT 系列醬香型白酒），市售；由GT 酒廠提供的一至七輪次醬香型白酒基酒。

試劑及耗材：無水磷酸氫二鉀（分析純），乙醇（色譜級），愈創木酚（Guaiacol，Gua；純度98.0%），4-甲基愈創木酚（4-Methylguaiacol，4-MG；純度＞98.0%），4-乙基愈創木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG；純度99.0%），4-甲基苯酚（4-Methylphenol，4-MP；純度≥99.7 %），4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP；純度97.0%），苯酚（Phenol，Phe；純度≥99.5%），4-乙烯基愈創木酚（4-Vinylguaiacol，4-VG；純度≥98.0%）均購自上海阿拉丁（aladdin）公司。

儀器設備：TQ8030 氣相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀，配備AOC-20i 自動進樣器，日本島津公司；ME204T 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-250E 超聲波發生器，昆山市超聲儀器有限公司；Vortex-Genie2 渦旋混合器，美國Scientific Industries 公司；Gen Pure xCAD Plus 純水機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 儀器檢測條件

色譜條件：色譜柱為Agilent DB-WAX 色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；程序升溫為初始柱溫100 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升溫至200 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣(純度＞99.999 %)，流量控制方式為線速度；壓力145.2 kPa；總流量9.0 mL/min；流速1.0 mL/min；線速度26.3 cm/s；進樣方式為不分流進樣；進樣量1 μL。

質譜條件：電離方式為電子電離源(elctron ionizotion，EI)；電離能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度230 ℃；監測方式為選擇離子掃描(single ion monitoring，SIM)；四級桿溫度150 ℃；溶劑延遲10 min。

1.2.2 標準溶液的制備

準確稱取Gua，4-MG，4-EG，4-MP，4-EP，Phe，4-VG 各49.4 mg，48.4 mg，47.4 mg，49.9 mg，56.7 mg，52.8 mg，50.5 mg，用色譜級無水乙醇定容至25 mL。取7種多酚化合物標準溶液各0.5 mL至100 mL 容量瓶中，用色譜級無水乙醇定容，作為標準中間液。分別取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL 中間液至10 mL 容量瓶中，再取0.2 mL 中間液至100 mL容量瓶中，定容，作為標準曲線點。

1.2.3 樣品前處理

酒樣混勻后放置磨口玻璃瓶內待用。準確量取酒樣5.00 mL 于10 mL 具塞磨口離心管中，向離心管中加入無水磷酸氫二鉀固體，直至飽和為止，靜置分層。取上清液2.0 mL 于2 mL 離心管中，加入無水硫酸鎂200 mg，渦旋1 min混勻，10000 r/min離心10 min，取上清液，供GC-MS/MS分析。

2 結果與分析

2.1 質譜定性與定量

取20 μg/mL的7種酚類化合物標準中間溶液，按照最佳色譜條件進行全掃描，得到7 種多酚化合物的總離子流色譜圖，見圖1；同時確定每種物質的保留時間、定性離子和定量離子，選擇結果見表1。由圖1 可知，7 種酚類化合物均實現了良好的分離，為準確定量分析奠定了基礎。由表1 可知，選定1 個定量離子，4 個定性離子，采用選擇離子掃描（SIM）模式進行數據的采集。

表1 7種酚類化合物保留時間、定性和定量離子

圖1 7種酚類化合物總離子流色譜圖

2.2 方法的線性范圍，檢出限與定量限

以質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。7 種酚類化合物的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限列于表2。由表2 可知，7 種酚類化合物在濃度范圍內線性關系良好，相關系數（R2）≥0.999。利用0.02 μg/mL 的濃度水平為依據，3 倍信噪比計算檢出限，10 倍信噪比計算定量限。

表2 7種多酚化合物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限與定量限

由表2 可以得出，Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-MP、4-EP、4-VG 的檢出限分別為0.0030 μg/mL、0.0031 μg/mL、0.0023 μg/mL、0.0023 μg/mL、0.0041 μg/mL、0.0011 μg/mL、0.0028 μg/mL，定量限分別為0.0101 μg/mL、0.0102 μg/mL、0.0075 μg/mL、0.0076 μg/mL、0.0137 μg/mL、0.0037 μg/mL、0.0093 μg/mL。本方法具有較低的檢出限與定量限，靈敏度能夠滿足醬香型白酒中酚類化合物的檢測需求。

2.3 回收率與精密度試驗

準確移取5 mL 的酒樣，分別按照低、中、高三個水平添加酚類化合物標準溶液，按照樣品前處理方法進行處理和測定不同酚類化合物的含量，每個濃度平行測定6 次，計算不同酚類化合物的平均回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表3。

由表3 可知，7 種酚類物質的加標回收率在90.74%～120.16%之間，精密度在1.17%～7.64%之間，回收率良好，精密度均小于10 %，滿足實驗檢測的要求。

表3 酚類物質加標回收率及精密度

2.4 酒樣檢測

2.4.1 醬香型白酒檢測

相關研究表明，酚類物質能為白酒提供獨特的焦醬味、奶香味、煙熏風味和窖泥味，是白酒風味組成不可缺少的一部分。但有些酚類化合物還會給酒體帶來異嗅味，如苯酚具有藥氣味、煙臭味，4-甲基苯酚具有窖泥臭、皮革臭、焦皮臭、動物臭，4-乙基苯酚呈動物臭、馬廄臭[24]，徐巖等[25]的研究證明4-甲基苯酚是濃香型白酒產生窖泥臭味的來源。4-乙基愈創木酚具有煙熏和丁香氣味，在濃度高時呈臭豆醬氣味，濃度低時似醬香空杯留香氣味[26-28]；愈創木酚具有水果香、焦醬香，楊玉波等[29]的研究表明，茅臺酒中愈創木酚的質量濃度與“糧香”強度具有正相關性，對“糧香”有著十分重要的作用。利用實驗所建立的分析方法，對不同品牌醬香型白酒中酚類化合物的含量進行測定，每個樣品平行測定2次，計算平均值，檢測結果見表4。

由表4 可知，所選不同品牌系列醬香型白酒中酚類化合物的含量存在差異。除JT4、JT5 未檢出Gua，LT4 未檢出Gua、4-EG、4-VG 及LT5 未檢出4-EG、4-VG 外，其余醬香型白酒樣品均檢測出7 種酚類化合物。Gua 的濃度范圍是0.0000～0.2020 μg/mL，含量最高的是MT3；4-MG 的濃度范圍是0.0095～0.1006 μg/mL，含量最高的是JT2；Phe 的濃度范圍是0.0447～0.1906 μg/mL，含量最高的是ZT3；4-EG 的濃度范圍是0.0000～0.0742 μg/mL，含量最高的是MT3；4-MP 的濃度范圍是0.0084～0.2426 μg/mL，含量最高的是GT5；4-EP 的濃度范圍是0.0017～0.0541 μg/mL，含量最高的是MT2；4-VG 的濃度范圍是0.0000～0.2043 μg/mL，含量最高的是GT5；酚類化合物總量的濃度范圍是0.1375～0.9268 μg/mL，含量最高的是GT5。4-EP 和4-EG 總量的濃度范圍是0.0072～0.1275 μg/mL，含量最高的是MT3，研究表明4-EP 和4-EG 的濃度在小于400 μg/L 或大于620 μg/L 時會對酒體造成不同的影響，小于400 μg/L 時，會使酒產生辛香、煙氣和革香韻的氣味，大于600 μg/L 時，會產生腥味，通過檢測可知，所選醬香型白酒中4-EP 和4-EG 的總量均小于400 μg/L，不會對酒體造成影響。對比分析7 個品牌的5 款系列醬香型白酒酚類化合物總量的平均值發現，GT 系列醬香型白酒中的含量最高，濃度為0.6354 μg/mL，其次是MT系列，濃度是0.5561 μg/mL，最低的是LT系列白酒，濃度是0.2175 μg/mL。

表4 醬香型白酒中酚類化合物 (μg/mL)

酚類化合物作為白酒中的健康活性物質，為健康飲酒奠定了一定的物質基礎。4-MG 和4-EG 可以抗氧化、有效的預防疾病、延緩衰老，促進人體健康，4-EG還可降低血糖活性[30-31]。愈創木酚在臨床上可用于治療慢性氣管炎的多痰咳嗽。但是苯酚不僅是一種有害的物質，含量過高時還會造成酒體出現異味，所以在白酒的生產過程要控制苯酚的含量[32]。

2.4.2 不同輪次醬香型白酒基酒檢測

醬香型白酒復雜的“12987”釀造工藝過程，即一年生產周期、兩次投糧、九次蒸煮、八次發酵、七次取酒，造就了其獨特的風格品質。由于不同季節環境、原料、大曲、微生物環境以及發酵過程酒醅性質的不斷變化，導致七個輪次基酒具有明顯不同的風格[33-34]。利用實驗所建立的分析方法，對GT 提供的七個輪次的醬香型白酒基酒中酚類化合物的含量進行測定，每個樣品平行測定5 次，計算平均值，檢測結果見表5。

表5 不同輪次醬香型白酒基酒酚類化合物 (μg/mL)

由表5 可以看出，一輪次基酒中酚類化合物總量最高，為0.0373 μg/mL，發酵初期，原料中生成酚類物質的前體物質較多，導致一輪次基酒中酚類物質含量最高；最低是三輪次，為0.2101 μg/mL。一輪次中的Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-VG 等物質含量也顯著要高于其他輪次基酒。四輪、五輪、六輪次酚類物質的質量濃度較為接近。了解不同輪次基酒中酚類物質的變化規律，有助于企業優化調控工藝，控制酒中酚類化合物含量。

3 結論

本研究采用雙水相萃取結合氣相色譜-質譜聯用法建立了一種簡單，快速，高效分析醬香型白酒中酚類化合物的方法。該方法可以快速測定7種酚類化合物，且分離效果良好，線性范圍為0.0200～10.0000 μg/mL，相關系數（R2）均大于0.999，精密度在1.17 %～7.64 %，回收率為90.74 %～120.16 %，檢出限為0.0011～0.0041 μg/mL，定量限為0.0037～0.0137 μg/mL。利用該方法測定不同品牌醬香型白酒及GT提供的一至七輪次的醬香型白酒基酒中酚類化合物含量，結果表明，除JT4、JT5 未檢出Gua，LT4未檢出Gua、4-EG、4-VG及LT5未檢出4-EG、4-VG外，其余醬香型白酒樣品均檢測出7種酚類化合物。Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-MP、4-EP、4-VG含量最高的分別是MT3（0.2020 μg/mL）、JT2（0.1006 μg/mL）、ZT3（0.1906 μg/mL）、MT3（0.0742 μg/mL）、GT5（0.2426 μg/mL）、MT2（0.0541 μg/mL）、GT5（0.2043 μg/mL）。酚類化合物總量的濃度范圍是0.1375～0.9268 μg/mL，含量最高的是GT5。4-EP 和4-EG 總量的濃度范圍是0.0072～0.1275 μg/mL，含量最高的是MT3，研究表明4-EP 和4-EG 的濃度大于620 μg/L 時會對酒體造成不良的影響，通過檢測可知，所選醬香型白酒中4-EP 和4-EG 的總量均小于400 μg/L，不會對酒體造成影響。對比分析系列醬香型白酒酚類化合物總量的平均值發現，GT 系列醬香型白酒中的含量最高，其次是MT 系列，最低的是LT 系列白酒。對輪次基酒的研究發現，一輪次基酒中酚類化合物總量最高，為0.0373 μg/mL；最低是三輪次，為0.2101 μg/mL。一輪次中的Gua、4-MG、Phe、4-EG、4-VG 等物質的含量也顯著要高于其他輪次基酒。四輪、五輪、六輪次中酚類物質的質量濃度較為接近。通過對基酒及成品酒中酚類化合物的研究，可以為企業積累數據，指導企業改進生產工藝，穩定酒中酚類化合物含量，對提升白酒品質具有重要意義。