乳腺非特殊型浸潤性癌外泌體microRNA表達譜探討

顏 晨 周文斌

1.攀枝花學院基礎醫學院，四川攀枝花 617000；2.深圳市人民醫院 暨南大學第二臨床醫學院 南方科技大學第一附屬醫院普通外科（乳腺甲狀腺專科），廣東深圳 518020

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1-2]。2021年美國癌癥協會數據顯示乳腺癌的新發病例數在所有癌癥中位居第一[3]。2015年國內乳腺癌發病率在中國女性所有癌癥中位居第一[4]。乳腺非特殊型浸潤性癌是最常見的乳腺癌組織學類型[5]。近年來液體活檢成為一種快速非侵入性的新型腫瘤檢測方法，其使用的生物學標志物不僅能同步跟蹤乳腺癌進展，為臨床診療提供信息，還能研究癌癥發生的潛在分子機制[6]。很多腫瘤相關研究指出外泌體能在細胞間傳遞信息，在腫瘤發生發展中起到非常重要的作用[7-8]。據報道外泌體轉運的microRNA進入靶細胞可調節mRNA轉錄，進而影響腫瘤多種生物學過程[9]。因此本研究通過測序比較早期和晚期乳腺非特殊型浸潤性癌患者和正常人群血漿中外泌體microRNA差異，尋找具備篩查潛力的外泌體microRNA，評估外泌體microRNA作為乳腺非特殊型浸潤性癌診斷血液標志物的潛在應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3—5月深圳市人民醫院（我院）乳腺非特殊型浸潤性癌早期患者5例、晚期患者5例作為研究對象。納入標準：①經病理學診斷確認為乳腺非特殊型浸潤性癌；②早期組腫瘤組織小于2 cm，無淋巴結及遠端轉移，晚期組腫瘤已經發生遠端轉移；③血常規、尿常規和心臟、肝臟、腎臟功能基本正常。排除標準：①妊娠期或哺乳期婦女；②合并其他惡性腫瘤患者；③具有嚴重的代謝性疾病及血液功能障礙患者；④嚴重感染患者。另選擇我院同期健康女性體檢者2例作為對照組。納入標準：臨床資料齊全、無心腦血管、肺、肝、腎疾病。排除標準：出血性腦血管病、腫瘤患者，嚴重的肝腎功能不全、血液系統疾病及自身免疫缺陷疾病患者。早期組5例，年齡43～67歲，平均（53.40±10.14）歲；晚期組5例，年齡42～63歲，平均（49.40±8.14）歲；對照組2例，年齡47～51歲，平均（49.00±2.83）歲。所有入組者均為女性，三組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 外泌體提取 使用抗凝管采集入組者6 ml血液樣本，離心后收集血漿，凍存于-80℃。應用ExoQuick Precipitation試劑盒進行外泌體提取，具體方法參照說明書：血漿樣本中加入外泌體提取試劑離心后，沉淀重懸于4倍血漿樣本體積的10 mM的PBS中。1.2.2 microRNA提取和測序 應用Trizol法進行外泌體總RNA提取，具體方法如下：在外泌體樣本中加入適量Trizol試劑再加入氯仿，混勻后離心，在上層水相加入2倍體積異丙醇，靜置后離心得到RNA沉淀，經75%乙醇洗滌和再溶解后凍存于-80℃。在RNA兩頭加上linker，應用PCR法對產物進行純化和擴增。應用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離microRNA，并通過膠回收試劑盒回收microRNA后，應用Illumina Hiseq 2500進行測序。

1.2.3 測序數據分析 應用Fastx toolkit軟件（版本號：0.0.14）去除下機數據中低質量數據，應用FastQC軟件（版本號：0.13.0）進行測序數據質量控制。應用miRTarBase數據庫中的人類成熟microRNA數據作為參照序列和測序結果進行比較和標注；使用RPKM作為基因定量表達單位。

應用edgeR方法分析差異基因表達數據，差 異 基 因 篩 選 閾 值 為：|log2（FoldChange）|＞1且P＜0.05。使用R語言軟件（版本號：3.6.3）對microRNA表達數據[log10（RPKM+1）]進行層次聚類分析。應用miRTarBase數據庫進行microRNA靶基因預測；應用topGO軟件對差異表達基因進行GO富集分析；基于KEGG數據庫，應用KOBAS軟件進行的差異表達基因的通路分析。應用OncoLnc工具進行預后分析。

1.3 統計學方法

所有數據使用SPSS 19.0統計學軟件進行統計學分析，采用Fisher’s檢驗比較不同組間差異外泌體microRNA表達情況，P＜ 0.05為差異有統計學意義，P＜ 0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 早期和晚期乳腺非特殊型浸潤性癌組外泌體microRNA表達情況

測序數據經處理后，分析結果顯示與正常組比較，早期和晚期乳癌組中的外泌體microRNA表達量均發生變化，具體如下：與正常組比較，晚期組有30個外泌體microRNA表達量上調，差異有統計學意義（P＜ 0.05），早期組有26個外泌體microRNA表達量上調，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與正常組比較，晚期乳腺癌有29個外泌體microRNA表達量下調，差異有統計學意義（P＜ 0.05），早期組有18個外泌體microRNA表達量下調，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與正常組比較，晚期乳腺癌有11個外泌體microRNA表達量上調，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01），早期組有11個外泌體microRNA表達量上調，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01）。與正常組比較，晚期乳腺非特殊型浸潤性癌組有5個外泌體microRNA表達量下調，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01），早期組有3個外泌體microRNA基因表達量下調，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01）。這些表達量有差異的外泌體microRNA具有潛在的診斷應用價值。

2.2 差異外泌體microRNA聚類分析

根據不同組間差異外泌體microRNA表達情況變化繪制火山圖，見圖1A；層次聚類分析結果顯示不同組間可根據差異外泌體microRNA表達數據成功聚類，見圖1B。說明這些差異外泌體microRNA可用來區別乳癌組及健康組，具有潛在的應用價值。

圖1 差異外泌體microRNA分布與聚類圖

2.3 差異外泌體microRNA通路分析

預測差異外泌體microRNA的靶基因后，再通過GO（The Gene Ontology）分析這些靶基因在生物過程（Biological Process，BP）、細胞組成（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）上的富集情況，以及這些靶基因在KEGG信號通路上的富集情況，取前20條最顯著富集通路進行交叉比較，結果見圖2；與正常組比較，差異外泌體microRNA靶基因富集通路有95%～60%的富集通路同時出現在早期和晚期乳癌組。這種重疊性說明這些差異外泌體microRNA同時在乳腺非特殊型浸潤性癌的發生和轉移中發揮作用。

圖2 差異外泌體microRNA靶基因前20條最顯著富集通路交叉比較韋恩圖

2.4 差異外泌體microRNA預后分析

選取與對照組比較，在早期和晚期乳癌組中表達量變化且差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01）的外泌體microRNA進行預后分析，結果見圖3。這說明圖中4個外泌體microRNA的表達量與預后具有一定的相關性，具有潛在的研究價值和臨床應用價值。

圖3 差異外泌體microRNA在乳腺非特殊型浸潤性癌預后分析

3 討論

外泌體是一種細胞外囊泡[7-8]。microRNA能夠通過誘導靶基因降解起到翻譯抑制作用[9]。研究表明外泌體microRNA能夠在細胞間傳遞信息，影響腫瘤發展進程，是一種理想的腫瘤非侵入性生物標志物[9]。

本研究發現有4個外泌體microRNA有潛力同時適用于早期和晚期乳腺非特殊浸潤性癌的血液學診斷，它們分別是miRNA-451a、miRNA-493-5p、miRNA-409-3p和miRNA-151a-5p。關于miRNA-151a-5p目前還沒有在乳腺癌方面的報道，但有報道稱其會在肝癌患者中發生顯著性減少而在惡性甲狀腺癌中會發生顯著上升[10-11]；關于miRNA-409-3p，有報道稱其與宮頸癌細胞增殖及順鉑化療敏感性相關[12]，其在小細胞肺癌中可靶向抑制Beclin-1的表達，從而影響化療藥物敏感性[13]；關于miRNA-493-5p，報道稱其可以通過調控VAMP2的表達來抑制肝癌細胞的成長發育、誘導其衰老凋亡[14]；關于miRNA-451a，有報道稱其和乳腺癌細胞的上皮間質轉化相關[15]。

本研究從臨床樣本出發，基于真實和客觀的已知病例情況，圍繞“應用外周血外泌體microRNA作為乳腺癌生物學標志物”開展研究，提供可用于乳腺癌血液學檢測的外泌體microRNA，為外泌體microRNA檢測成為一種無創的乳腺癌血液學檢測方法提供理論參考。