基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)探討夏天無治療胃癌的機(jī)制

黃文安 何智博 劉 俊▲

1.九江學(xué)院醫(yī)學(xué)院，江西九江 332005；2.九江學(xué)院外國語學(xué)院，江西九江 332005

夏天無為罌粟科紫堇屬延胡索亞屬植物伏生紫堇的塊莖，主產(chǎn)于江西、湖南、福建、浙江、安徽等省份，以江西產(chǎn)質(zhì)量為佳，具有活血通絡(luò)、行氣止痛的功效[1]。夏天無在臨床上常用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病、腰椎間盤突出癥、坐骨神經(jīng)痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[2]。雖然夏天無的臨床療效顯著，應(yīng)用廣泛，但其在癌癥治療中研究較少，對癌癥的治療也僅限于對胃癌疼痛有減輕效果[3]，并且不良反應(yīng)率低。但是夏天無的藥理學(xué)研究基礎(chǔ)相對薄弱，尤其對其單體的抗癌活性及作用機(jī)制缺乏系統(tǒng)深入的研究。

中醫(yī)藥治療和預(yù)防癌癥在中國有著悠久的歷史，因其在一定程度上能夠協(xié)同增效和降低西藥毒性而越來越受到人們的重視[4]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究將傳統(tǒng)的中草藥與現(xiàn)代藥理學(xué)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)相結(jié)合，探討夏天無治療胃癌的有效成分及潛在機(jī)制，可能為復(fù)雜中藥的機(jī)制研究提供研究策略。

1 材料與方法

1.1 夏天無潛在成藥成分及對應(yīng)靶點的確定

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）和分析平臺（https: //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）將口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為評價指標(biāo)，篩選夏天無有效成分及對應(yīng)靶點。中醫(yī)藥證候關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫和中醫(yī)大百科全書（http: //www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/index.html）對靶點及對應(yīng)的成分進(jìn)行進(jìn)一步合并篩選。Unitprot數(shù)據(jù)庫（http: //www.Uniport.org/）用于翻譯夏天無相關(guān)靶基因。

1.2 胃癌相關(guān)靶基因獲取

將“gastric cancer”作 為 搜 索 關(guān) 鍵 詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲得人類胃癌相關(guān)靶基因。

1.3 “夏天無有效成分-靶基因-胃癌”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny在線數(shù)據(jù)庫（https: //bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將1.1中獲得的夏天無相關(guān)靶基因與1.2中獲得的胃癌靶基因進(jìn)行交互映射，獲得交集基因。將夏天無有效成分、交集基因和胃癌相關(guān)信息導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“夏天無有效成分-靶基因-胃癌”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶蛋白與靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫（http: //string-db.org/）將1.3中獲得的交集基因進(jìn)行多蛋白相互作用分析，將“最低蛋白相互作用分值（minimum required interaction score）”設(shè)置為0.900，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.2軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步可視化分析，篩選關(guān)鍵靶點。

1.5 基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）代謝通路富集分析

將1.4中獲得的關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫基因信息列表，獲得關(guān)鍵靶點的GO富集分析及KEGG代謝通路富集分析數(shù)據(jù)，將篩選條件設(shè)置為P＜ 0.01，F(xiàn)DR＜ 0.01，利用R軟件對結(jié)果進(jìn)行圖表可視化分析。

1.6 夏天無靶基因與胃癌預(yù)后分析

進(jìn)入GEPIA 2數(shù)據(jù)庫，選擇survival analysis，將1.3獲得的交集靶基因依次進(jìn)行預(yù)后分析，其中癌癥類型選擇胃腺癌（stomach adenocarcinoma），方法選擇總生存期（overall survival，OS），其余為默認(rèn)值，log rankP＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 夏天無潛在有效成分及靶點的獲得

根據(jù)篩選條件獲得6種夏天無有效成分（表1），對應(yīng)67個靶點，其中65個與胃癌相關(guān)，72個靶基因。

表1 夏天無主要活性成分基本信息

2.2 胃癌相關(guān)靶基因

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，獲得胃癌相關(guān)基因11 842個。

2.3 “夏天無有效成分-靶基因-胃癌”網(wǎng)絡(luò)圖

Venn映射分析獲得了65個藥物與疾病的交集基因（圖1），對應(yīng)6種夏天無有效成分。“夏天無有效成分-靶基因-胃癌”網(wǎng)絡(luò)中共有72個節(jié)點（有效成分6個，靶基因65個，疾病1種）和454條相互作用的邊（圖2）。

圖1 Venn分析

圖2 “中藥化合物-作用靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

PPI網(wǎng)絡(luò)中有共65個相互作用節(jié)點，139條相互作用連線（圖3）。Cytoscape 3.7.2進(jìn)一步可視化分析得到45個關(guān)鍵靶基因（圖4），其中F2、CHRM1、HTR2A及ADRA1B等蛋白度值相對較高，ESR1與NCOA1，CALM1與CALM2、NOS2、CALM3、NOS3以及NCOA1與ESR2、RXRA、RXRB之間相互作用程度較高。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 夏天無治療胃癌關(guān)鍵靶基因網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能分析

GO富集分析結(jié)果顯示，夏天無治療胃癌的關(guān)鍵靶基因主要影響的前20位的功能信息如下（P＜ 0.01，F(xiàn)DR＜ 0.01）。生物過程方面：腺苷酸環(huán)化酶抑制G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號通路、調(diào)節(jié)心肌收縮、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)的乙酰膽堿受體信號通路等；分子功能方面：一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性、G蛋白偶聯(lián)的乙酰膽堿受體活性、藥物結(jié)合；細(xì)胞組成方面：質(zhì)膜的組成部分、質(zhì)膜、軸突末端等（圖5）。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG代謝通路富集分析

KEGG代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，夏天無治療胃癌的關(guān)鍵靶基因顯著富集在18條通路上（P＜ 0.01，F(xiàn)DR＜ 0.01），見圖6，其中有2條通路與胃癌關(guān)系密切。圖表顯示夏天無治療胃癌主要影響的通路有鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等多條途徑。

圖6 KEGG代謝通路分析（P ＜ 0.01，F(xiàn)DR＜ 0.01）

2.7 夏天無靶基因與胃癌預(yù)后分析

使用GEPIA 2數(shù)據(jù)庫進(jìn)行胃癌預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)ADRA1A、ADRA1B、AR、ESR1、F7、OPRD1、PTGS2、RXRA等基因的生存曲線的log rankP均＜0.05（圖7），其中RXRA高表達(dá)的胃癌患者比RXRA低表達(dá)的胃癌患者中位生存期長，其余基因均為低表達(dá)水平時更能延長患者的中位生存時間。

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法借助相關(guān)數(shù)據(jù)庫和軟件對夏天無治療胃癌的作用機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果顯示，夏天無治療胃癌的6種有效成分主要是生物堿類。研究表明，生物堿具有良好的抗腫瘤活性。其中，bicuculline能有效抑制人肝癌MHCC97-H細(xì)胞的遷移和侵襲[5]，F(xiàn)umarine通過刺激人結(jié)腸癌中的p53通路發(fā)揮抗增殖作用[6]，在用palmatine光動力處理后，HT-29細(xì)胞的凋亡率顯著增加[7]。這6種有效成分對應(yīng)的雄激素受體（androgen receptor，AR）[8]、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）[9]、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP 90）[10]和雌激素受體（estrogen receptor，ESR1）[11]等靶點均與胃癌治療有關(guān)。有效的AR拮抗劑能夠抑制AR信號傳導(dǎo)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[12]。CDK2的表達(dá)與胃癌的Borrmann分型和腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜ 0.01）。另外，CDK2的表達(dá)還與胃癌浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。HSP 90α表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參數(shù)（包括患者存活率）之間的相關(guān)性，相比HSP 90α低表達(dá)組，HSP 90α高強(qiáng)度表達(dá)組腫瘤體積較大且腫瘤浸潤更明顯。高HSP 90α表達(dá)水平也與淋巴浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期（TNM期≥Ⅲ）疾病顯著相關(guān)。HSP 90α表達(dá)水平高的患者的生存率明顯低于HSP 90α表達(dá)水平低的患者。據(jù)此推測，HSP 90α過表達(dá)可能與胃癌患者的疾病進(jìn)展和生存率有關(guān)[14]。

PPI結(jié) 果 顯 示，ESR1與NCOA1、CALM2和NOS2等蛋白兩兩間存在較強(qiáng)的相互作用關(guān)系。NCOA1屬于類固醇受體輔助活化因子家族成員之一，它在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[15]。ESR與F2、ADR家族成員和CHRM家族成員等在胃癌治療中均有較強(qiáng)的中藥作用。腎上腺素能受體（adrenergic receptor，ADR）、ESR的活化與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。從信號通路分析，Ca2+主要參與細(xì)胞遷移，基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞死亡等[16]，Ca2+濃度的增加可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[17]。神經(jīng)活性配體-受體信號通路是細(xì)胞膜上連接所有細(xì)胞內(nèi)外信號通路相關(guān)的受體和配體的主要信號通路[18]。

在預(yù)后分析中發(fā)現(xiàn)ADRA1A、ADRA1B、AR、ESR1、F7、OPRD1、PTGS2、RXRA等因子的表達(dá)水平與胃癌患者的預(yù)后起到關(guān)鍵性作用。有研究證實ESR與腫瘤預(yù)后存在一定的關(guān)聯(lián)[19]。在激素相關(guān)的癌癥中，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌，ESRα表達(dá)主要通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路促進(jìn)疾病進(jìn)展[20]。然而，高ESRα表達(dá)也與結(jié)直腸癌患者的不良生存結(jié)果顯著相關(guān)[21]。因此，ESRα的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，它的作用是雙向的。

綜上所述，胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個相對復(fù)雜的過程，它是一條由多基因、多因素和多信號通路交織的網(wǎng)絡(luò)。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)分析夏天無治療胃癌的潛在有效活性成分及對應(yīng)的關(guān)鍵靶點，分析夏天無治療胃癌的主要信號通路，為闡明其抗胃腫瘤的具體作用機(jī)制提供客觀依據(jù)，也為今后進(jìn)一步挖掘夏天無的臨床功效提供理論支持，夏天無作為江西特有中草藥，本研究為夏天無更好的服務(wù)于臨床提供一定參考價值。但本研究并未考慮藥物劑量、藥物成分質(zhì)量和給藥方式對治療結(jié)果的影響。因此，需要進(jìn)一步的研究來驗證本研究結(jié)果。