抗奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌-細菌素的篩選及特性研究

涂會鑫，董文龍，孟雨晴，張 涵，徐菁岐

（吉林農業科技學院 動物科技學院，吉林吉林 132109）

奶牛乳房炎是一類嚴重危害奶牛養殖業的常發疾病，給世界奶牛養殖業造成了嚴重的經濟損失。其中細菌性乳房炎可造成奶牛產奶量下降，牛奶品質降低，嚴重時可導致生產性能喪失（張倩等，2017）。研究表明，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）誘發的奶牛乳房炎，在某些奶牛場感染率達50%以上（Bannerman等，2008）。目前國內外預防和治療奶牛乳房炎大多使用抗生素，抗生素濫用導致臨床致病株耐藥性不斷增強。奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌耐藥菌株數顯著增加，其耐藥性也不斷增強（劉肖利等，2021）。尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）流行株逐年增多，常誘發慢性和復發性奶牛乳房炎，使臨床治療更加困難。其中ST9作為我國MRSA中最常見的分子分型，已在中國香港、浙江和上海的牛源MRSA中檢出（Boost等，2013）。孟丹（2018）和Yi（2018）研究發現，新疆奶牛養殖業流行的臨床型奶牛乳房炎MRSA表現為多重耐藥，并從牛乳中分離到人源性ST188，ST9。此外Zhou（2017）和Li（2017）研究發現，我國上海、江蘇、浙江等地區檢出ST630的奶牛源MRSA菌株。因此研發新型替抗產品用于奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的防治已迫在眉睫。

乳酸菌在自然界中廣泛存在，是人和動物腸道中的有益微生物。乳酸菌能夠發酵原料中的糖生成乳酸、過氧化氫、細菌素和其他有機酸等產物，這些物質特別是細菌素可有效抑制某些病原菌的生長（王利君等，2020）。細菌素（bacteriocin）是由一部分革蘭氏陽性菌和陰性菌在生長代謝過程中通過核糖體合成并分泌到環境中的一類具有抑菌活性的蛋白類物質，具有高效、安全、無毒、無殘留等特點，在新型天然抑菌劑研究與開發中有著巨大應用潛力，可作為代替抗生素的新型抗菌藥物（Gálvez等，2007）。

為此本研究以金黃色葡萄球菌為指示菌，從奶酪樣品中分離到一株產細菌素乳桿菌（LS-1），并進一步研究其細菌素的生物學特性，為開發一種新型天然替抗藥物防治金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 菌株LS-1由內蒙古手工奶酪中分離獲得。金黃色葡萄球菌（S.aureus）ATCC25923、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、化膿隱秘桿菌（Trueperella pyogenes）ATCC19411。金黃色葡萄球菌S1、金黃色葡萄球菌S2，大腸桿菌E1、大腸桿菌E2，化膿隱秘桿菌T1、化膿隱秘桿菌T2，均為奶牛源臨床分離株，由吉林農業科技學院動物科技學院動物微生物與免疫研究室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離培養 用無菌鑷子取適量奶酪于MRS瓊脂培養基，涂布均勻，37℃恒溫培養箱靜置培養24 h。平板挑取不同菌落于MRS瓊脂培養基劃線純化，直至鏡檢觀察得到形態相同的菌體。挑起單個菌落接種于MRS液體培養基，37℃恒溫增殖培養18 h，-80℃甘油保存。

1.2.2 拮抗菌株的初篩 將分離活化后的菌株按照1：300的比例接種于300 mL的LB液體培養基，37℃條件下振蕩培養24 h。取出發酵液，3500 r/min離心45 min，使用0.22μm濾膜，真空泵抽濾除菌，初步得到發酵上清液，再放入旋轉蒸發儀中濃縮至30 mL得到發酵上清濃縮液。采用瓊脂擴散法測定各菌株無菌上清濃縮液的抑菌活性：將金黃色葡萄球菌ATCC25923的菌液濃度調整為1×108cfu/mL左右，在MH瓊脂培養基上均勻涂布后打孔（直徑約為8 mm），每孔加入200μL除菌上清濃縮液，室溫靜置1 h，37℃恒溫培養24 h。測量抑菌圈直徑，篩選出產抗菌物質菌株。

1.2.3 拮抗菌株的復篩 將活性菌株無菌上清濃縮液分成三組，第一組加入過氧化氫酶至終濃度為1 mg/mL，37℃水浴2 h，然后沸水浴煮5 min；第二組配制與無菌上清濃縮液具有相同pH的乳酸；第三組不做任何處理作為對照組。采用上述瓊脂擴散法將各組處理樣品加入孔洞中，靜置1 h，37℃恒溫培養24 h。除去因產生過氧化氫和酸性物質起到抑菌作用的菌株。

1.2.4 LS-1的菌落、菌體形態 將菌株接種MRS瓊脂培養基中，37℃恒溫培養24 h。挑取單個菌落，滴加一滴生理鹽水于載玻片上稀釋，酒精燈火焰上加熱固定，按照革蘭氏染色試劑盒說明書進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態。

1.2.5 LS-1的16SrRNA鑒定 用DNA提取試劑盒提取LS-1的基因組，以提取的DNA模板對LS-1的16SrRNA片段進行擴增。通用引物如下（Moreno 等，2002）：16S rRNA -F：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16SrRNA-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到長度正確的PCR產物，合格樣品送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序所獲得的16S rRNA序列與NCBI數據庫進行同源比對。

1.2.6 LS-1細菌素生物學特性測定

1.2.6.1 酶對細菌素的影響 將發酵上清濃縮液分為4份，加入2 mg/mL蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）。胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶置于37℃水浴，木瓜蛋白酶60℃水浴，4 h后100℃加熱5 min終止反應（Zhu等，2014）。以發酵上清濃縮液為對照組，進行抑菌試驗。方法同上。

1.2.6.2 溫度對細菌素的影響 將發酵上清濃縮液分為4份，于40、60、80℃水浴2 h，100℃水浴10 min，以發酵上清濃縮液為對照組，進行抑菌試驗。方法同上。

1.2.6.3 pH對細菌素的影響 用1 mol/L的乳酸、1 mol/L氫氧化鈉分別將發酵上清濃縮液的pH調至4.0、7.0、9.0、11.0，室溫靜置1 h后pH調回至5.0，以發酵上清濃縮液為對照組，進行抑菌試驗。方法同上。

1.2.6.4 抑菌譜的測定 取-80℃所儲存指示菌（9株）復蘇活化，接種到適宜液體培養基，于37℃恒溫培養24 h。采用平板計數法將菌液濃度調整為1×108cfu/mL左右，使用瓊脂擴散法進行抑菌試驗，并記錄抑菌圈直徑。

以上所有抑菌試驗均進行3次，測量抑菌圈直徑，取其平均值。

2 結果

2.1 產細菌素菌株的篩選 通過瓊脂擴散法篩選到一株產細菌素菌株LS-1（圖1），經復篩排除過氧化氫、有機酸的影響。發酵液經過過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑大小不變，說明菌株的抑菌活性與過氧化氫無關。與發酵液具有相同pH的乳酸產生的抑菌圈直徑變小，說明發酵液產生的乳酸具有一定的抑菌作用，但起不到決定作用。因此可以初步判定LS-1具有抗菌作用主要是因為細菌素。

圖1 LS-1發酵液對金黃色葡萄球菌ATCC25923的抑菌效果

2.2 產細菌素菌株的鑒定

2.2.1 LS-1的分離培養及鏡檢結果 菌株LS-1在MRS固體培養基上劃線37℃培養24 h，觀察可見其表面乳白光滑、圓形突起、邊緣整齊（圖2）。將單菌落革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體為陽性短桿、無芽孢（圖3）。

圖2 LS-1菌落形態

圖3 LS-1的革蘭氏染色鏡檢圖（1000×）

2.2.2 LS-1的16SrRNA鑒定 通過16S rRNA基因引物，PCR擴增菌株LS-1的16S rRNA片段，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，可得到一條位于1500 bp左右的條帶（圖4）。測序結果與NCBI數據庫進行序列比對，該菌株與Lacticaseibacillus saniviri（L.saniviri）同源性為98.71%。

圖4 16S rRNA基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

2.2.3 細菌素穩定性的測定 發酵液經過木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理后失去抑菌活性，由此推斷LS-1的發酵液中的抑菌成分是一種細菌素（表1）。LS-1的細菌素具有良好熱穩定性。發酵液經過不同溫度處理后，抑菌效果有所下降，但是抑菌活性依舊接近80%（抑菌活性=試驗組抑菌圈/對照組抑菌圈×100%）。LS-1的細菌素具有較好的酸堿穩定性。細菌素在pH為4.0、7.0、9.0時保持良好抑菌活性，且抑菌活性不低于70%，pH＞9.0時抑菌活性消失（表1）。

表1 蛋白酶、溫度、酸堿對LS-1的細菌素活性影響

2.2.4 抑菌譜的測定 LS-1的細菌素對奶牛乳房炎主要病原菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、化膿隱秘桿菌）均有不同程度的抑菌作用。LS-1細菌素對金黃色葡萄球菌標準株、奶牛源臨床分離株的抑菌作用最好，抑菌圈＞30 mm（表2）。整體而言，LS-1細菌素具有較高的抑菌活性。

表2 LS-1細菌素的抑菌譜

3 討論

近年來，在世界各國的奶牛業疫病中，金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的防治問題十分突出，也是我國奶牛業中具有重大經濟學意義的疾病。金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎常常誘發乳房出血，溶血素是該菌一種重要的致病因子，其中α溶血素對人類有致病作用（魏志恒等，2009）。目前奶牛場常用防治和治療措施仍然是使用抗生素，而金黃色葡萄球菌極易產生針對常用抗生素的耐藥性，多重耐藥性MRSA的出現使奶牛乳房炎很難治愈（龐盛林，2014）。

耐藥性是所有抗菌性藥物必然會遇到的問題，細菌素與抗生素一樣也會有耐藥性菌株的出現，但其出現的概率在1×10-9～1×10-8，比抗生素的概率要低得多（Guinane等，2010）。研究表明，產細菌素菌株在自然界中普遍存在，30%～99%的細菌和古生菌可以產生至少一種細菌素（Gao等，2022）。此外，細菌素對多種蛋白酶敏感，不易殘留或產生抗藥性，安全性高。另外細菌素對高溫、酸性的耐受能力強，可用于開發抗生素類、激素類的替代藥品（Riley等，2007）。其中乳酸菌細菌素在安全性、抑菌性等其他活性研究方面逐漸被認識，并成為蛋白質研究的一個熱點（Xiang等，2021）。然而用于臨床的細菌素極少，目前只有乳酸鏈球菌產生的Nisin已被允許作為食品防腐劑，實現工業化（王利君等，2020）。許女等（2016）發現，KF1細菌素對多重耐藥金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，主要的毒力因子具有明顯的抑制作用。陳宏偉等（2020）發現了5株代謝產生細菌素對乳房炎源金黃色葡萄球菌發揮抑制生長作用的菌株。

本研究以金黃色葡萄球菌為指示菌，從奶酪中分離得到一株產細菌素菌株LS-1，通過16S rRNA序列對比分析，鑒定菌株LS-1為L.saniviri。LS-1所產細菌素對奶牛乳房炎主要病原菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、化膿隱秘桿菌）均具有良好抑菌活性。此外LS-1所產細菌素具有良好的酸堿穩定性和熱穩定性。菌株LS-1豐富了產細菌素菌株資源，為研究防治金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的新型藥物奠定了基礎，有著廣闊的應用前景。