富含抗菌脂肽的微生態(tài)制劑制備及應(yīng)用效果研究

杜秀園，朱鋒釗，陳 敏，鄔小蘭，劉彥彥，胡美忠

（銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁 554300）

畜禽產(chǎn)品是人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)中重要的蛋白質(zhì)來(lái)源，然而在畜禽生產(chǎn)過(guò)程中，為了提升經(jīng)濟(jì)效益，存在抗生素不規(guī)范使用、促生長(zhǎng)類(lèi)激素濫用、獸藥大量應(yīng)用導(dǎo)致殘留等問(wèn)題，極大地影響了食品安全。因此，2020年7月1日，國(guó)家出臺(tái)了相關(guān)政策法規(guī)，禁止在飼料添加劑中使用抗生素，故尋找綠色、安全、可靠的新制劑是當(dāng)前畜禽養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題（金爾光等，2017）。

抗菌脂肽是芽孢桿菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等方面有廣闊的應(yīng)用前景（張嫚等，2004）。近年來(lái)，以抗菌脂肽作為保健制劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)并取得了良好應(yīng)用效果的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。研究表明，抗菌脂肽在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料利用率、提高胴體品質(zhì)等方面有著積極的作用（朱文斌，2021）。亦有研究表明，將抗菌脂肽和芽孢桿菌等益生菌配伍應(yīng)用，可在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮良好的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)提高養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、機(jī)體免疫力和飼料轉(zhuǎn)化率，達(dá)到替代抗生素和促生長(zhǎng)類(lèi)激素，從而減少獸藥使用，保障食品安全的目的。鑒于此，本試驗(yàn)擬通過(guò)研究Bacillus subtilis S21固態(tài)發(fā)酵工藝，獲得以較低成本生產(chǎn)富含抗菌脂肽的微生態(tài)制劑的工藝，并對(duì)其應(yīng)用效果進(jìn)行初步考察。

1 試驗(yàn)材料

1.1 主要培養(yǎng)基質(zhì) 豆粕、黃豆、玉米碴，均為本地市場(chǎng)采購(gòu)。

1.2 菌種與培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis S21，由本實(shí)驗(yàn)室篩選自銅仁市菜園土壤，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），保藏編號(hào)為：CGMCC No:15544。所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。

1.3 主要儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)為EXPE R T15K-R），由湖南吉爾森科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為BPH-9042），由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋（型號(hào)為HVE-50）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)為XT5118LOV240），由杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司生產(chǎn)；安捷倫1100型高效液相色譜儀，由安捷倫科技有限公司生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 固態(tài)發(fā)酵不同培養(yǎng)基質(zhì)加水量的篩選 選取玉米碴、黃豆、豆粕作為主要培養(yǎng)基質(zhì)，分別按料液比（g/mL）為1:0.5，1:1，1:1.5加入水（1 L水含蔗糖30 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.1 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸錳0.1 mg，硫酸銅0.03 mg，硫酸鐵0.03 mg），混勻放置12 h，蒸鍋蒸1 h后冷卻至室溫，按培養(yǎng)基質(zhì)重量的10%（g/mL）接種菌液，37℃培養(yǎng)72 h，干燥至含水量低于10%，取干燥樣品約5.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇至總體積為50 mL，超聲10 min，過(guò)濾，測(cè)定干燥發(fā)酵樣品中抗菌脂肽的含量。

2.2 培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件的篩選 分別以玉米碴、黃豆、豆粕為主要培養(yǎng)基質(zhì)考察對(duì)象，按料液比1:1加入水，考察氧氣、蔗糖、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。發(fā)酵完畢的樣品處理同2.1，然后測(cè)定樣品中抗菌脂肽的含量。

表1 抗菌脂肽微生態(tài)制劑培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件篩選

2.3 富含抗菌脂肽微生態(tài)制劑的制備工藝 通過(guò)篩選確定培養(yǎng)基為豆粕：水=1:1（1 L水含蔗糖30 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.1 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸錳0.1 mg，硫酸銅0.03 mg，硫酸鐵0.03 mg），基質(zhì)配制完成放置12 h，后置于多層大型蒸鍋中，每層厚度為3～5 cm，加熱蒸煮1 h，冷卻后接種，打開(kāi)蒸鍋?lái)攲油笟饪准跋旅嫱笟饪祝箍諝庑纬蓪?duì)流，控制蒸鍋下面加熱器，使溫度維持在30℃左右，培養(yǎng)60 h后，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，干燥溫度為50℃，烘干至含水量＜10%，粉碎至能100%通過(guò)40目篩，且95%以上能通過(guò)60目篩。封口袋包裝，避光處保存。并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行抗菌脂肽含量及芽孢數(shù)檢測(cè)。

2.4 抗菌脂肽含量和孢子數(shù)的測(cè)定

2.4.1 抗菌脂肽測(cè)定方法 采用HPLC法進(jìn)行抗菌脂肽含量測(cè)定（陳敏等，2021）。色譜條件：色譜柱為5TC-C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量20μmol，流動(dòng)相為90%乙腈（有機(jī)相和水相中均加入0.1%的三氟乙酸）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取抗菌脂肽（sigma）標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，分別配制成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液，取上述各溶液分別進(jìn)樣測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到抗菌脂肽標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度（mg/mL）的關(guān)系函數(shù)為：Y=6920.7X+404.36，R2=0.9976（Y為峰面積，X為濃度）。樣品的檢測(cè)：取自制微生態(tài)制劑約5 g，精密稱定，加入甲醇10 mL，密塞，超聲10 min，離心（8000 r/min）10 min，取甲醇上清液，將上清液按照上述HPLC定量檢測(cè)方法測(cè)定其中抗菌脂肽含量，重復(fù)測(cè)定3次取平均值。

2.4.2 孢子數(shù)測(cè)定方法 采用平板菌落計(jì)數(shù)法，具體參照GB/T 26428（飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)）方法進(jìn)行。

2.5 養(yǎng)殖應(yīng)用試驗(yàn)

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 選取本地品種青腳土雞苗100只，隨機(jī)分成5組，1～4組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.20%、0.30%、0.40%、0.50%的自制微生態(tài)制劑，5組（對(duì)照組）飼喂基礎(chǔ)日糧，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只。早晚各飼喂1次，自由采食，定期清理糞便，保障雞舍內(nèi)衛(wèi)生，飼養(yǎng)員每日巡視雞舍，挑出死亡雞只，計(jì)算死亡率。分別于供食雞苗20、35、50日齡對(duì)各試驗(yàn)組進(jìn)行空腹稱重，且每日記錄每組給料量和剩料量，計(jì)算平均日采食量及料重比。

2.5.2 基礎(chǔ)日糧組成 參考本地土雞飼養(yǎng)的日糧組成配制基礎(chǔ)日糧，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表2 雛雞基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

3 結(jié)果與分析

3.1 加水量對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響 固態(tài)發(fā)酵需要控制好加水量，水量少不利于發(fā)酵劑菌種生長(zhǎng)，水量過(guò)多不利于干燥，且對(duì)于需氧菌，不利于通氣。本試驗(yàn)分別以豆粕、黃豆、玉米渣為培養(yǎng)基質(zhì)，不同加水量對(duì)發(fā)酵和抗菌脂肽產(chǎn)量的影響見(jiàn)表3。

從表3可以看出，以豆粕和黃豆為培養(yǎng)基質(zhì)，其與水的最佳比例為1:1，此時(shí)含水量適宜，培養(yǎng)基質(zhì)濕潤(rùn)、透氣性較好，菌生長(zhǎng)良好，能獲得較高的抗菌脂肽發(fā)酵產(chǎn)量，且后期干燥耗能較低。而以玉米碴為培養(yǎng)基質(zhì)，其與水的最佳比例為1:0.5，但以玉米碴為培養(yǎng)基質(zhì)，抗菌脂肽發(fā)酵產(chǎn)量較低。故將培養(yǎng)基質(zhì)與水的比例確定為1:1。

表3 加水量對(duì)發(fā)酵和抗菌脂肽含量的影響

3.2 培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響 不同培養(yǎng)基質(zhì)、不同培養(yǎng)條件對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量的影響結(jié)果見(jiàn)表4（僅對(duì)有氧并有蔗糖的培養(yǎng)條件下抗菌脂肽的含量進(jìn)行了方差分析）。

從表4可知，氧氣對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量影響較大，無(wú)氧條件下，很難發(fā)酵產(chǎn)生抗菌脂肽；溫度方面，30℃相對(duì)于室溫，更有利于抗菌脂肽產(chǎn)生，其中以豆粕和黃豆為培養(yǎng)基質(zhì)，在30℃有氧條件下，抗菌脂肽含量都超過(guò)了600 mg/kg；蔗糖作為碳源，對(duì)菌種的代謝也很重要，缺乏蔗糖，不利于發(fā)酵產(chǎn)生抗菌脂肽；培養(yǎng)時(shí)間方面，除豆粕和黃豆在室溫條件下，發(fā)酵60 h與72 h比較存在極顯著差異（同行數(shù)據(jù)比較，P＜0.01）；其余組別在其他條件一致的情況下（有氧，添加蔗糖，發(fā)酵溫度相同），發(fā)酵60 h與72 h相比抗菌脂肽的產(chǎn)量沒(méi)有顯著性差異（同行數(shù)據(jù)比較，P＞0.05），但與發(fā)酵48 h相比，抗菌脂肽的產(chǎn)量有極顯著提高（同行數(shù)據(jù)比較，P＜0.01），出于節(jié)能和高效的考慮，選擇培養(yǎng)時(shí)間為60 h。培養(yǎng)基質(zhì)方面，三種培養(yǎng)基質(zhì)中，玉米碴在各種培養(yǎng)條件下的抗菌脂肽產(chǎn)量均低于豆粕和黃豆。比較以豆粕和黃豆作為培養(yǎng)基質(zhì)，在有氧、添加蔗糖、30℃條件下，培養(yǎng)相同時(shí)間，抗菌脂肽產(chǎn)量沒(méi)有顯著性差異（同列數(shù)據(jù)比較，P＞0.05），從成本角度出發(fā)，選擇豆粕作為主要培養(yǎng)基質(zhì)。

表4 幾種不同培養(yǎng)基質(zhì)在不同條件下的抗菌脂肽發(fā)酵產(chǎn)量

3.3 富含抗菌脂肽微生態(tài)制劑的制備 按照2.3所述制備方法，一次可生產(chǎn)富含抗菌脂肽的微生態(tài)制劑產(chǎn)品20 kg，對(duì)關(guān)鍵指標(biāo)抗菌脂肽進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其含量在400～600 mg/kg，與小批量生產(chǎn)相比，抗菌脂肽產(chǎn)量略有下降。根據(jù)GB/T 26428（飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)）方法，對(duì)上述產(chǎn)品進(jìn)行芽孢數(shù)檢測(cè)，其6個(gè)月后芽孢數(shù)仍大于1×109cfu/g。

3.4 養(yǎng)殖應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果3.4.1 雛雞日增重測(cè)定結(jié)果 由表5可知，20～35日齡日均增重1～4組與5組（對(duì)照組）之間有顯著差異（P＜0.05），1組與3組、4組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；試驗(yàn)1、2、3、4組較對(duì)照組分別提高了56.59%、56.77%、38.96%、35.62%；35～50日齡日均增重1～4組與5組（對(duì)照組）之間有顯著差異（P＜0.05），1組與2組、4組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；試驗(yàn)1、2、3、4組較對(duì)照組分別提高了43.10%、43.57%、63.17%、46.24%。

表5 雛雞日增重測(cè)定結(jié)果g

3.4.2 雛雞死亡率和料重比測(cè)定結(jié)果 由表6可知，整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)照組雛雞死亡率最高，為20.00%，1～4組死亡率均低于對(duì)照組，其中3組和4組無(wú)死亡雞只。料重比方面，1～4組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；20～35 d，試驗(yàn)1、2、3、4組較對(duì)照組分別降低了19.25%、24.88%、14.08%、13.61%；35～30 d，試驗(yàn)1、2、3、4組較對(duì)照組分別降低了9.38%、9.82%、18.30%、9.38%。

表6 雛雞死亡率和料重比測(cè)定結(jié)果

4 討論與結(jié)論

由于豆粕中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其成為了動(dòng)物養(yǎng)殖中蛋白質(zhì)資源的首選（胡瑞等，2013）。但由于其成分特點(diǎn)，如氨基酸含量不平衡、存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子等，使其不易被完全消化，且豆粕質(zhì)地結(jié)構(gòu)較致密、硬度高，導(dǎo)致其適口性較差，這些因素降低了其的應(yīng)用價(jià)值。而利用發(fā)酵技術(shù)，可使其在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，且質(zhì)地由致密變得較蓬松，從而提高其適口性，促進(jìn)動(dòng)物采食（劉星等，2020）。并且通過(guò)微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的高質(zhì)量發(fā)酵豆粕中，大分子蛋白質(zhì)被分解為小肽分子，小肽具有吸收耗能低，吸收速率快，不易飽和等特點(diǎn)，使發(fā)酵后豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大幅度提高（李瑩等，2019）。發(fā)酵還可產(chǎn)生蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多種生物活性物質(zhì) （辛娜等，2020），對(duì)于動(dòng)物更好的消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，起到積極的作用。

枯草芽孢桿菌是一種在飼料添加劑發(fā)酵中常用的菌株，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，在動(dòng)物飼料中以芽孢的形式存在，可防止其在加工過(guò)程中被破壞，它同時(shí)也是一種常見(jiàn)的益生菌，動(dòng)物食用添加了該菌種的飼料后，可調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，同時(shí)還可以提高動(dòng)物的免疫力，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育（宋立立等，2014）。歐榮娣等（2014）利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵米糠，將其拌入日糧中飼喂臨武鴨，試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，日料中添加枯草芽孢桿菌可有效提高臨武鴨日均增重，降低料重比和死亡率。李衛(wèi)芬等（2011）研究了枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響，結(jié)果表明，在基礎(chǔ)日糧中添加0.75 g/kg的枯草芽孢桿菌制劑，肉雞的日增重顯著高于飼喂基礎(chǔ)日糧組。

固態(tài)發(fā)酵是指在有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)中，用一種或多種微生物進(jìn)行發(fā)酵的生物反應(yīng)過(guò)程（王永偉等，2019；李衛(wèi)芬等，2011）。由于其具有操作簡(jiǎn)便、耗能較低、條件不嚴(yán)苛以及有利于微生物生長(zhǎng)繁殖等優(yōu)勢(shì)，使其在發(fā)酵領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，而且很適合枯草芽孢桿菌這種需氧菌的發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵氧氣充足，可使枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)旺盛，并產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等多種生物酶，從而使原料中的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（劉桂香等，2016），以利于動(dòng)物吸收。

本研究使用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S21作為發(fā)酵劑，采用固態(tài)發(fā)酵的方式發(fā)酵豆粕。其試驗(yàn)研究表明，以蔗糖為碳源，加入微量無(wú)機(jī)鹽，接種量為10%，發(fā)酵溫度為30℃，采用固態(tài)發(fā)酵方式，發(fā)酵60 h，實(shí)現(xiàn)了以較低成本生產(chǎn)富含抗菌脂肽的微生態(tài)制劑的目的，發(fā)酵產(chǎn)物抗菌脂肽含量≥0.4 mg/g，且芽孢數(shù)＞1×109cfu/g。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，本產(chǎn)品提高了豆粕中營(yíng)養(yǎng)成分在動(dòng)物體內(nèi)的吸收利用率，改善了口感口味，應(yīng)用本產(chǎn)品后能夠達(dá)到降低料重比，改善雛雞生長(zhǎng)性能、促肥增長(zhǎng)的效果，且由于其富含抗菌脂肽和芽孢，二者的協(xié)同作用具有增強(qiáng)免疫力的效果，應(yīng)用后降低了雛雞死亡率，從而降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。