白芥子誘導的雞內源性芥子堿降解菌的篩選、鑒定及酶活測定

鄧 卉，余 丹，范景勝，屈 東，鄒成義，李 斌，殷 勤，鄭鈺嘉，倪青松，汪林書

（四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

我國優質飼料原料高度依賴進口，2020年進口大豆超1億t，在新冠疫情和中美貿易戰的雙重壓力下，原料價格進一步飛漲。由此，《國務院辦公廳關于促進畜牧業高質量發展的意見》（國辦發〔2020〕31號）中明確提出促進菜籽粕等非糧飼料資源高效利用，促進豆粕減量替代。芥子堿作為菜籽粕、白芥子等十字花科類植物原料的重要抗營養因子，極大限制了該類原料在工業飼料中的應用。利用微生物自身分泌的酶降解芥子堿的生物技術方法是目前最安全、最有效的手段之一，本研究通過白芥子誘導試驗，從雞的盲腸中篩選出一株能有效降解芥子堿的細菌，經鑒定為大腸桿菌，并進一步考察了該菌及其功能酶漆酶在不同培養時間對芥子堿的降解效果，為高效利用十字花科類非糧型飼料原料提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 培養基 芥子堿液體培養基，由（NH4）2SO4、NaCl、K2HPO4、MgSO4.7H2O、KCl、FeSO4、芥子堿硫氰酸鹽和蒸餾水組成；伊紅美藍固體培養基；LB液體培養基；芥子堿+LB液體培養基（芥子堿：LB=3：2）。

1.2 菌株篩選與鑒定

1.2.1 動物試驗日糧及采樣 在藏香雞基礎日糧中添加20%白芥子飼喂28 d后，無菌條件下分別采集雞空腸、回腸、盲腸內容物存放于無菌生理鹽水中，待分離培養目標菌株。基礎日糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養水平

1.2.2 分離培養目標菌株 將采集的雞空腸、回腸、盲腸內容物分別接種于芥子堿+LB液體培養基中，37℃、180 r/min搖床振蕩培養48 h。取芥子堿+LB培養液在伊紅美藍固體培養基上劃線，37℃恒溫培養24 h。挑取伊紅美藍培養基上單個菌落到芥子堿液體培養基中，37℃、180 r/min搖床振蕩培養72 h。再取芥子堿培養液在伊紅美藍固體培養基上劃線，37℃恒溫培養36 h。最后挑取伊紅美藍培養基單個菌落到LB液體培養基中，于37℃富集培養12 h，將獲得的純化菌株凍存-20℃冰箱備用。

1.2.3 菌株種屬鑒定 形態學鑒定：采用形態學鑒定法觀察伊紅美藍培養基上菌株的培養特征和菌落形態，并結合革蘭氏染色法在100×顯微鏡下觀察菌株染色形態特征。參照《伯杰細菌鑒定手冊》初步鑒定其種屬。

分子生物學鑒定：提取獲得菌株基因組DNA，以通用引物進行PCR擴增。引物序列為27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTG TTACGACTT。PCR反應條件為：98℃3 min；98℃10 s，55℃15 s，72℃10～15 s/kb，39個循環；72℃5 min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離、檢測，切膠純化后送至北京擎科生物科技有限公司測序，所得16SrDNA基因序列在GenBank里進行序列比對，下載GenBank中同源性較高序列，并利用MEGA-X軟件的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.3 測定獲得菌株降解芥子堿效果 將獲得菌株接種到芥子堿液體培養基中，空氣搖床37℃培養72 h。從第0 h開始，每隔8 h測定培養液中芥子堿的含量，比較獲得菌株在不同培養時間對芥子堿的降解效果。設置3個重復，結果取平均值。

采用紫外分光光度法測定芥子堿含量：精密稱取芥子堿硫氰酸鹽對照品（含量≥98.0%）37.0 mg，溶于10 mL蒸餾水中制成溶液。分別精密吸取上述溶液3、4、5、6、8、10、15、20μL，用水稀釋至3 mL，搖勻后即得濃度分別為0.0037、0.0049、0.0062、0.0074、0.0099、0.0123、0.0185、0.0247 mg/mL的芥子堿對照品溶液，以蒸餾水為空白對照，在326 nm波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標繪制標準曲線并進行線性回歸分析。取樣品培養液15μL加蒸餾水稀釋至3 mL，搖勻后在326 nm波長下測定吸光度，根據標準曲線計算出培養液芥子堿含量。

1.4 測定獲得菌株漆酶活力 以2，2'-連氮基-雙（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）為底物，分別在第8、16、24、32、40、48 h采用可見分光光度計在420 nm下測定培養液漆酶活力。以每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmoL底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.5 統計分析 運用Excel對相關數據繪制回歸曲線、建立回歸方程以及確立復相關指數R2，再采用SPSS 17.0軟件對回歸方程進行方差分析（ANOVA），以P＜0.05作為差異顯著的判斷標準，以P＜0.01作為差異極顯著的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選 初步篩選結果顯示，在腸道不同位置取樣會影響目標菌的培養，本試驗條件下，盲腸中培養出的目標菌明顯多于空腸和回腸（表2）。

表2 雞腸道不同取樣位置條件下目標菌的培養情況

選擇篩選數最多的盲腸段目標菌繼續培養觀察，發現上述盲腸中篩選出的9株菌均能夠利用芥子堿作為營養物質生長，肉眼觀察其中1株目標菌在芥子堿培養液中渾濁度明顯高于其他8株，并且在伊紅美藍培養基上的生長情況明顯優于其他8株，將該菌株命名為SDB2（Sinapine-degrading bacteria 2）。

2.2 SDB2種屬鑒定

2.2.1 形態學鑒定 在伊紅美藍培養基上，菌株SDB2長滿整個平板，菌落呈圓形、突起、邊緣規則的形狀且帶有翠綠色金屬光澤，初步判定為典型的大腸桿菌菌落。采用革蘭氏染色法對單菌落染色后在100×顯微鏡下觀察后判定該菌為革蘭氏陰性短桿菌。

2.2.2 分子生物學鑒定 由圖1可知，菌株SDB2屬于Escherichia sp，273-c菌株。因此將SDB2菌株鑒定為變形菌門；γ-變形菌綱；腸桿菌目；腸桿菌科；大腸埃希菌。

圖1 基于16S rDNA序列構建SDB2菌株的系統發育樹

2.3 SDB2降解芥子堿效果研究 由圖2可知，吸光度A與濃度C建立的線性回歸方程為A=54.1106C+0.0329，復相關指數R2=0.9989。

圖2 芥子堿對照品標準曲線

由表3可知，芥子堿濃度隨培養時間增加，總體上呈降低趨勢，第72 h濃度最低，降低幅度達50%。

表3 SDB2菌株不同培養時間對芥子堿濃度的影響

進一步對芥子堿濃度與培養時間建立回歸方程并做方差分析，結果如圖3和表4所示。芥子堿濃度與SDB2菌株培養時間存在極顯著的線性回歸關系（P<0.01），復相關指數R2=0.9368，芥子堿濃度隨培養時間增加而降低。

表4 芥子堿濃度與SDB2菌株培養時間建立回歸方程的方差分析

圖3 芥子堿濃度與SDB2菌株培養時間的線性回歸關系

2.4 SDB2漆酶活力 分別在第8、16、24、32、40、48 h測定芥子堿培養液的漆酶酶活，結果由表5可知，SDB2菌株漆酶活力第8 h最高，達7.38 U/mL，之后漆酶活力逐漸降低，第48 h最低。

表5 不同培養時間對SDB2菌株漆酶活力的影響

進一步對漆酶活力與培養時間兩者建立回歸方程并做方差分析，結果如圖4和表6所示。漆酶活力與培養時間存在極顯著的線性回歸關系（P<0.01），復相關指數R2=0.9957，漆酶活力隨SDB2菌株培養時間增加而降低。

圖4 SDB2菌株漆酶活力與培養時間的線性回歸關系

表6 SDB2菌株漆酶活力與培養時間建立回歸方程的方差分析

對漆酶活力與芥子堿濃度兩者建立回歸方程并做方差分析，結果如圖5和表7所示。漆酶活力與芥子堿濃度存在極顯著的線性回歸關系（P<0.01），復相關指數R2=0.9630，漆酶活力與芥子堿濃度呈正相關，芥子堿濃度高，則漆酶活力高，反之芥子堿濃度低，則漆酶活力低。

圖5 漆酶活力與芥子堿濃度的線性回歸關系

表7 漆酶活力與芥子堿濃度建立回歸方程的方差分析

3 結論與討論

本研究通過白芥子誘導試驗，從雞盲腸中篩選出一株能有效降解芥子堿的菌株SDB2，鑒定為大腸桿菌。將該菌株接種到芥子堿液體培養基中能有效降解芥子堿。芥子堿濃度與培養時間存在極顯著的線性回歸關系，芥子堿濃度隨培養時間增加而降低，芥子堿在72 h內的降解率可達50%；SDB2功能酶漆酶活力與培養時間存在極顯著的線性回歸關系，漆酶活力隨培養時間增加而降低；漆酶活力與芥子堿濃度存在極顯著的線性回歸關系，漆酶活力與芥子堿濃度呈正相關，芥子堿濃度高，則漆酶活力高，反之芥子堿濃度低，則漆酶活力低。

前人為降低菜籽粕、白芥子等十字花科類植物原料中芥子堿的含量也做了一些嘗試，Lucht（1998）采用化學法使芥子堿含量降低至檢測限以下，但菜籽粕中賴氨酸的含量下降了20%；Thiyam等（2006）用含水甲醇、乙醇等作為溶劑去提取芥子堿，存在溶劑損耗大、污染環境等問題，不利于生產應用；Mailer等（2009）和Mittasch等（2010）開展了利用轉基因技術特異性地沉默芥子堿在植物中生物合成代謝，從而降低芥子堿含量的品種選育研究，但至今尚無商品化品種出現，并且此舉會使芥子堿在十字花科類植物所發揮的生理代謝調控、提高植物抗病性和改善營養品質的重要功能喪失，無法統籌考慮芥子堿在生長植物中的營養功能角色和飼料原料中的抗營養因子角色。

采用生物技術方法降解芥子堿是目前最先進、最安全的技術手段之一，其原理是利用微生物自身分泌的功能性生物酶破壞芥子堿的分子結構，從而達到降解芥子堿的目的。芥子堿屬于簡單酚類物質，有關研究報道，多酚氧化酶、酪氨酸酶、阿魏酸酯酶、β-葡萄糖苷酶等能有效降解芥子堿（柯木根等，2007）。Lacki等（1996）發現，采用白腐真菌分泌的酶（多酚氧化酶為主）在水溶液中可酶解98%以上的芥子堿和芥子酸；鈕琰星（2013）報道，蘑菇中提取的酪氨酸酶是一種一元酚氧化酶，能在30～40℃水解芥子堿，最終分解成苯醌或者其他衍生物，并在反應過程中發現有色物質的產生；Qiao等（2002）發現，阿魏酸酯酶可在50～60℃水解芥子堿，但不能繼續分解其降解產物芥子酸；周浩宇等（2011）發現，β-葡萄糖苷酶對芥子堿具有一定的降解作用，降解率達17%。而漆酶作為一種多酚氧化酶，多存在于微生物中，其催化范圍廣，可催化氧化鄰、對苯二酚等多元酚及其衍生物，催化氧化底物類型已達250個，但目前關于漆酶降解芥子堿的研究鮮見報道。Yu等（2016）發現，篩選出的芥子堿降解菌YD-1和YD-2的胞外產物含有蛋白酶、淀粉酶和脲酶；余丹等（2020）發現，篩選出的芥子堿降解菌SDB1具有漆酶、淀粉酶、多酚氧化酶、乙酰膽堿酯酶和脂肪酶的活性，不具有β-葡萄糖苷酶的活性。本研究采用雞盲腸中篩選出的優勢大腸桿菌SDB2去降解芥子堿，結果表明降解效果非常顯著，同時也發現SDB2對芥子堿的降解與其所含漆酶的活性密切相關，漆酶活性與芥子堿濃度呈正相關，提示SDB2以芥子堿為營養物質分泌漆酶，芥子堿濃度高呈正營養狀態時，則漆酶活性高，而隨著漆酶對芥子堿的降解，引起芥子堿濃度降低呈現負營養狀態，因此漆酶活性降低。余丹等（2020）篩選出的SDB1屬于肺炎克雷伯氏菌屬，該研究表明在培養液中分別添加0.40 g/L和0.80 g/L的芥子堿均可以提高SDB1漆酶活力，而本研究在培養過程中沒有添加芥子堿作為營養補充，結合此前研究結果推測此為引起漆酶活力下降的原因，可為后續研究方法提供參考依據。

綜上所述，為提高菜籽粕等非糧飼料資源的高效利用，本文采用安全有效的微生物發酵酶解技術去降解芥子堿等抗營養因子，在新冠疫情和中美貿易的雙重壓力下，具有十分重要的意義和廣闊的應用前景。