不同處理方法對中草藥體外抑菌及抗氧化活性的影響

王寶剛，楊立軍，曹鵬亮，梁曉凱，汪金萍，陳 瓊*

（1.信陽農林學院食品學院，河南信陽 464000；2.信陽農林學院制藥工程學院，河南信陽 464000）

為防治疾病，禽畜生產養殖過程中約有60多種抗生素被用于動物臨床治療中，大量抗生素的使用會導致禽畜體內微生物菌群失調并產生耐藥性（Zhang，2015）。劉肖利等（2021）從采集的7個奶牛場中患乳房炎奶牛乳汁樣本分離出5株金黃色葡萄球菌，結果顯示這些金黃色葡萄球菌最少耐1種藥，最多耐5種藥物，部分耐藥率為60%～80%；張璐等（2020）研究表明，雞白痢沙門菌2001—2010年比1970—2000年藥物耐藥率及耐藥種類升高；Xin等（2021）分析2008—2017年美國食品和藥物管理局收集的46937份禽肉樣本的數據，表明與減少抗生素使用樣本中的分離株相比，常規樣本中的沙門氏菌分離株對三種或三種以上抗菌藥物的耐藥幾率（多重耐藥）高2.61倍。在養殖過程中減少抗生素的使用勢在必行，2018年農業農村部組織制定了《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案（2018-2021年）》。

中草藥具有多成分、多靶點、多途徑、多環節特點，在診治禽畜感染性疾病方面被證實有一定的療效，可在一定程度上降低多重耐藥菌發病的風險。馮平等（2017）表明，連翹、黃連、金銀花、魚腥草、蒲公英可作為藥物預防和治療奶牛乳房炎。蒲公英、金銀花、菊花作為藥食兼用的傳統中藥材在我國使用歷史悠久，均具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤的功效 （朱文卿，2021；周衡樸，2019；Nikzad，2017）。本文通過探索不同處理方法對蒲公英、金銀花、菊花這三種中藥材抑菌效果和抗氧化活性的影響，旨在為它們在禽畜養殖方面的應用提供一定的參考。

1 試驗材料

1.1 測試菌種 金黃色葡萄球菌、甲型副傷寒沙門氏菌均由信陽農林學院制藥工程學院微生物實驗室提供，這兩種菌均為禽畜類常見致病菌。

1.2 中草藥與試劑 蒲公英、金銀花、菊花購自信陽美銳大藥房；乳酸菌購自信陽恒大華聯超市，蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、營養瓊脂均購自上海博微生物科技有限公司；DPPH、鄰苯三酚均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 主要儀器 SW-CJ-2FD實用型雙人單面垂直凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；XFH-75CA型電熱壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫療器械有限公司產品；DNP型電熱恒溫培養箱，寧波江南儀器廠產品；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋，北京中興偉業世紀儀器有限公司產品；RE52CS型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品；Tu-1900紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品。

2 試驗方法

2.1 7種組方組合方法 將三種中草藥按照不同方式進行組合，共7組，分別為：A組蒲公英12.0 g，B組金銀花12.0 g，C組菊花12.0 g，D組蒲公英、金銀花各6.0 g，E組蒲公英、菊花各6.0 g，F組金銀花、菊花各6.0 g，G組蒲公英、金銀花、菊花各4.0 g。

2.2 水煎煮處理方法 將以上7種組方分別加入100 mL的蒸餾水浸泡30 min，再加熱煎煮30 min后，用紗布過濾，濾渣再加水提取2次，合并3次濾液得水煎煮原液。將水煎煮原液于50℃、50 r/min旋轉蒸發濃縮至浸膏狀，用蒸餾水定容得濃縮液（1.0 g/mL）。濃縮液用濾膜（孔徑0.45μm）過濾裝于無菌具塞試劑瓶內密封，4℃保存備用。

2.3 乳酸菌發酵處理方法 將7種組方分別裝入300 mL三角瓶中，加入蒸餾水200 mL，密封。將三角瓶置于65℃水浴鍋中，保溫30 min，進行巴氏消毒。無菌條件下，稱取0.4 g乳酸菌粉加入巴氏消毒后的7組三角瓶中，然后將它們放于恒溫培養箱中，37℃發酵7 d，每24 h手動晃動一次。發酵結束，將發酵液進行抽濾得發酵濃縮液，后續操作同2.2。

2.4 體外抑菌試驗

2.4.1 培養基制備 肉湯培養基制備：取蛋白胨10.0 g，牛肉膏粉3.0 g，氯化鈉5.0 g，加1000 mL蒸餾水，加熱溶解，121℃滅菌30 min。營養瓊脂制備：取營養瓊脂粉33.0 g，加1000 mL蒸餾水，加熱溶解，121℃滅菌30 min。

2.4.2 菌懸液制備 在無菌條件下，取甲型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌各一菌環接種于肉湯培養基試管，37℃靜置培養24 h，取出，使用無菌水調整菌懸液濃度約106～107CFU/mL。

2.4.3 藥敏片制作 用打孔器制作若干圓形濾紙片（直徑6 mm），將其按需分裝入2 mL離心管中，高壓滅菌后，加入不同處理方法所得的7種組方中草藥濃縮液，室溫放置30 min，無菌條件下取出濾紙片于無菌平皿中，50℃條件下烘干，4℃保存，備用。

2.4.4 濾紙片法測體外抑菌效果 用移液槍吸取50μL測試菌懸液滴加到制備好的營養瓊脂平板上，用涂布棒涂布均勻。待其表面無水后用無菌鑷子將制備好的藥敏片貼附于培養基上，37℃培養18 h，取出，用游標卡尺十字交叉法測量抑菌圈直徑。判定標準：抑菌圈直徑（d）＞20 mm為極敏，15 mm＜d≤20 mm為高敏，10 mm＜d≤15 mm為中敏，d≤10 mm為低敏，“—”表示無抑菌圈（姚火春，2012）。

2.5 抗氧化性試驗 利用得到的各種提取物原液進行超氧陰離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力的測定，具體參考姜峰（2021）方法。

2.6 數據的統計分析 試驗數據采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析（S-N-K檢驗）和多重比較，試驗結果表示為“平均值±標準誤”，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

3 結果與分析

3.1 體外抑菌試驗3.1.1 7種組方水煎煮液體外抑菌效果 由表1可知，7種組方水煎煮濃縮液，對金黃色葡萄球菌和甲型副傷寒沙門氏菌均表現出不同的抑制效果，不同組方之間均表現差異顯著（P＜0.05）；金黃色葡萄球菌對E組表現出高敏，對A、B、D、F、G組表現為中敏，對C組表現為低敏，最大E組（蒲公英+菊花）比最小C組（菊花）抑菌圈直徑大68%；甲型副傷寒沙門氏菌對A組表現出極敏，對G組表現出高敏，對D、E、F組表現為中敏，對B、C組表現為低敏，最大A組（蒲公英）比最小C組（菊花）抑菌圈直徑大224%。

表1 7種組方水煎煮液抑菌圈直徑mm

3.1.2 7種組方乳酸菌發酵液體外抑菌效果 由表2可知，7種組方乳酸菌發酵濃縮液，對金黃色葡萄球菌和甲型副傷寒沙門氏菌均有較好的抑制效果，不同組方之間均表現差異顯著（P＜0.05）；金黃色葡萄球菌對B、D、F、G組表現極敏，對A、C、E組表現為高敏，最大F組（金銀花+菊花）比最小C組（菊花）抑菌圈直徑大61%；甲型副傷寒沙門氏菌對A、C、D、F、G組方表現極敏，對B組方表現為高敏，最敏感的D組（蒲公英+金銀花）比最小B組（金銀花）抑菌圈直徑大62%。

表2 7種組方乳酸菌發酵液抑菌圈直徑mm

3.1.3 不同處理方式抑菌效果比較 為了較直觀地比較水煎煮和乳酸菌發酵抑菌效果的差異，按測試致病菌不同將7種組方抑菌圈直徑如圖1、圖2所示。從圖1和圖2看出，針對金黃色葡萄球菌和甲型副傷寒沙門氏菌，每種組方的乳酸菌發酵液均比水煎煮液抑制效果好。依次對比從A組到G組的抑菌圈直徑，乳酸菌發酵較水煎煮，對于金黃色葡萄球菌分別提高了63%、75%、65%、85%、20%、135%、112%，對于甲型副傷寒沙門氏菌分別提高了12%、128%、329%、123%、89%、106%、81%。

圖1 不同處理方式對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

圖2 不同處理方式對甲型副傷寒沙門氏菌的抑菌效果

3.2 抗氧化試驗

3.2.1 7種組方水煎煮液抗氧化效果 由表3可知，7種組方水煎煮原液，對超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有不同程度的清除能力，不同組方之間均表現差異顯著（P<0.05）；對超氧陰離子自由基清除能力依次為G組＞D組＞B組＞F組＞E組＞C組＞A組，G組（蒲公英+金銀花+菊花）比A組（蒲公英）清除率高263%；對DPPH自由基清除能力依次為B組＞C組＞G組＞F組＞D組＞E組＞A組，B組（金銀花）比A組（蒲公英）清除率高127%。

表3 7種組方水煎煮液抗氧化能力%

3.2.2 7種組方乳酸菌發酵液抗氧化效果 由表4可知，7種組方乳酸菌發酵原液，對超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有不同程度的清除能力，組方之間均表現差異顯著（P＜0.05）；對超氧陰離子自由基清除能力依次為E組＞C組＞G組＞A組＞D組＞B組＞F組，E組（蒲公英+菊花）比F組（金銀花+菊花）清除率高440%；對DPPH自由基清除能力依次B組＞F組＞C組＞D組＞E組＞G組＞A組，B組（金銀花）比A（蒲公英）組清除率高137%。

表4 7種組方乳酸菌發酵液抗氧化能力%

3.2.3 不同處理方式抗氧化活性比較 按自由基不同，將7種組方的水煎煮液和乳酸菌發酵液的抗氧化活性進行比較，如圖3、圖4所示。從圖3和圖4看出，針對超氧陰離子自由基和DPPH自由基，每種組方的清除效果均是乳酸菌發酵液比水煎煮液高。依次對比從A組到G組抗氧化結果，乳酸菌發酵較水煎煮，對于DPPH自由基分別提高了23%、28%、16%、44%、49%、37%、8%；對于超氧陰離子自由基分別提高了287%、9%、798%、22%、535%、14%、104%。

圖3 不同處理方式對超氧陰離子自由基清除能力

圖4 不同處理方式對DPPH自由基清除能力

4 討論與結論

水煎煮是我國中草藥臨床應用最早、最廣泛方法之一。通過煎煮，可減少藥物的副作用降低毒性（周友紅，2010），促進藥物有效成分的浸出（黃斯，2015），利于組方中其他難溶性、揮發性物質析出（張明明，2012）。發酵法也是中草藥炮制方法的一種，如常用的六神曲、淡豆豉、百藥煎等就是通過發酵炮制的中草藥。中草藥通過發酵可提高有效成分的提取率（楊新波，2022），降低毒副作用（Lin，2020），并產生新的成分（Chen，2019），中草藥發酵尤其是益生菌發酵中草藥越來越受重視。

乳酸菌作為益生菌發酵中草藥在禽畜養殖中有較好的應用效果。郭宏偉等（2019）統計發現，投喂經乳酸菌發酵的生乳散比沒發酵生乳散的妊娠母豬產活仔數高10.09%。李雪雁等（2020）用乳酸菌發酵添加了黃芪、淫羊霍、甘草等的飼料飼喂雛雞，4～5周后統計得出發酵中草藥制劑提高了雛雞生長性能，降低了料肉比。

本試驗利用乳酸菌發酵蒲公英、金銀花、菊花三種中草藥的7種組方，它們的抑菌效果和抗氧化活性均高于水煎液。可能是由于經乳酸菌發酵后，產生了一些新的物質，如有機酸（胡愛心，2021）、細 菌 素（Baliv，2016）、過 氧 化 氫（Knaus，2017）等，它們均被證明有一定的抑菌及抗氧化活性（張開屏，2021），這與其他中藥發酵結果有相似之處。如白俊毅等（2020）表明，連梔礬發酵后抑菌效果增加，并經HPLC測定發現發酵后連梔礬溶液活性成分發生變化，產生了新的成分，其認為這些是發酵后抑菌活性增強的原因；鄭慧敏等（2021）對五谷蟲粉水提物發酵前后抑菌試驗進行了比較，證明發酵后五谷蟲粉的抑菌效果提高；張紅艷等（2021）表明，發酵中草藥方劑相比直接熬制，鋅、銅、鐵和鈣的含量顯著提高，DPPH自由基的清除能力提高2.2倍，羥基自由基的清除能力提高4.2倍，總多酚含量提高了2.2倍，對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌活性更強。

綜上所述，本試驗條件下，對金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳的是乳酸菌發酵金銀花+菊花組方，抑菌圈直徑為（24.39±1.63）mm；對甲型副傷寒沙門氏菌抑制效果最好的是乳酸菌發酵蒲公英+金銀花組方，抑菌圈直徑為（31.58±0.95）mm；對超氧陰離子自由基清除能力最強的是乳酸菌發酵蒲公英+菊花組方，清除率為（100±1.93）%；對DPPH自由基清除能力最強的是乳酸菌發酵金銀花組方，清除率為（85.47±2.56）%；7種組方之間抑菌效果和抗氧化活性方面均存在顯著差異性；乳酸菌發酵液抑菌效果和抗氧化活性均優于水煎煮液，抑菌圈直徑比水煎液提高12%～329%，抗氧化能力比水煎液提高8%～798%。