四味穿心蓮散水煎劑防治禽致病性大腸桿菌病療效研究

張利勃，單文琪，王宏軍*，孫 健，田莉莉，蔣 紅，劉國(guó)權(quán)

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧錦州 121001；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京房山 102400）

四味穿心蓮散源自《中華人民共和國(guó)獸藥典》，由穿心蓮、大青葉、辣蓼和葫蘆茶組成，具有清熱解毒、澀腸止痢、抗菌消炎的作用，對(duì)禽致病性大腸桿菌（APEC）引起的雞心包炎、肝周炎、氣囊炎、卵黃性腹膜炎等有特效。汪艷秋等（2013）、班燕桃等（2020）采用薄層色譜法定性鑒別了四味穿心蓮散中的大青葉；包愛(ài)情等（2016）用高效液相色譜法測(cè)定了四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量；張遂平等（2016）完成了四味穿心蓮散固體分散體及其制備方法的研究；王林等（2017）采用薄層色譜法鑒別四味穿心蓮超微粉中含有穿心蓮內(nèi)脂、脫水穿心蓮內(nèi)脂、靛玉紅、蘆丁及槲皮素；陶松若等（2020）開(kāi)展了四味穿心蓮散及其組方中單味中藥水煎劑對(duì)沙門菌的體外抑菌試驗(yàn)。但目前關(guān)于四味穿心蓮散抗大腸桿菌及其體內(nèi)效果方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)將該復(fù)方的水煎劑用于APEC病的治療，為雞大腸桿菌病的治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌CVCC251購(gòu)自于中國(guó)獸藥藥品監(jiān)察所中國(guó)獸生物菌種保存管理中心。

1.1.2 藥物 穿心蓮、大青葉、葫蘆茶和辣蓼均購(gòu)買于國(guó)安市順全隆中藥材有限公司，經(jīng)鑒定符合中華人民共和國(guó)獸藥典要求。氟苯尼考可溶性粉，山東福美樂(lè)動(dòng)物藥業(yè)有限公司。

1.1.3 試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、EC肉湯、瓊脂粉、麥康凱瓊脂，北京奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡海蘭褐雛雞200只，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；雛雞飼料，購(gòu)自錦州東正飼料有限公司。

1.1.5 主要儀器 HC-1000Y型高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）；KQ-300B型超聲波振蕩清洗器（昆明市儀器有限公司）；雙人雙面凈化工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州凈化）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DSCS的制備 將穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶4味中草藥飲片粉碎，按照中國(guó)獸藥典處方比例組方，加入10倍量水，超聲處理30 min，煎煮2 h，收集濾液，然后再加入5倍量水煎煮1 h，重復(fù)一次，合并濾液，濃縮至1 g/mL藥液。

1.2.2 抗菌活性的測(cè)定 將大腸桿菌CVCC251菌株凍干粉在EC肉湯增菌培養(yǎng)24～48 h，用徐淑云等（1994）提出的活菌計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)菌濃度為104cfu/mL，采用Jiang等（2013）提出的微孔-平板法測(cè)定提取物對(duì)試驗(yàn)菌株的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 APEC病理模型的建立 隨機(jī)挑選180只10日齡雛雞，按照蔣紅等（2012）的方法攻毒制備APEC病理模型。按照陳溥言（2015）方法依據(jù)臨床癥狀、病理剖檢、顯微觀察及劃線接種麥康凱瓊脂平板，菌落呈紅色即可初步診斷為雞大腸桿菌病。

1.2.4 臨床治療試驗(yàn) 待動(dòng)物表現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，隨機(jī)分成5組，每組20只，設(shè)DSCS高劑量組（3 mL/只）、中 劑 量 組（1.5 mL/只）和 低 劑 量 組（0.5 mL/只），氟苯尼考可溶性粉組（1 mg/只），感染對(duì)照組（不給藥組），另設(shè)一組健康對(duì)照組（不給菌不給藥組）。連續(xù)給藥5 d，停藥后繼續(xù)觀察20 d，記錄動(dòng)物的臨床表現(xiàn)、疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和消失情況。按照《獸用中藥、天然藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求計(jì)算無(wú)效率、有效率、顯效率、治愈率。

治愈率/%=（癥狀體征、實(shí)驗(yàn)室檢查與專業(yè)特異指標(biāo)均轉(zhuǎn)為正常的動(dòng)物數(shù)）/發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100；

顯效率/%=滿足以上其中三項(xiàng)的動(dòng)物數(shù)/發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100；

有效率/%=（痊愈+顯效動(dòng)物數(shù)）/發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100；

無(wú)效率/%=100-有效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 用IBM SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌結(jié)果 四味穿心蓮散水煎液對(duì)大腸桿菌CVCC251菌株的MIC為7.82 mg/mL，MBC為31.25 mg/mL。

2.2 治療結(jié)果 由圖1所示，氟苯尼考組動(dòng)物治愈率、顯效率、有效率及無(wú)效率分別為85%、90%、90%和10%，四味穿心蓮散水煎劑治療組治愈率為75%～90%，顯效率為80%～95%，有效率為90%～95%，無(wú)效率為5%～10%。四味穿心蓮散水煎劑高劑量組治愈率與氟苯尼考組有顯著性差異（P＜0.05），中劑量組甚至略高于氟苯尼考組，表明中草藥水煎劑組治愈APEC的療效優(yōu)于氟苯尼考，并且中草藥水煎劑組的顯效率、有效率和無(wú)效率與氟苯尼考組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。后續(xù)跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，四味穿心蓮散水煎劑組雛雞的生長(zhǎng)和抗病能力優(yōu)于氟苯尼考組。

圖1 四味穿心蓮散水煎劑防治APEC結(jié)果

3 小結(jié)

雞大腸桿菌病是由禽致病性大腸埃希氏菌（APEC）引起的一種細(xì)菌性傳染病。該病多呈現(xiàn)混合感染、易產(chǎn)生耐藥性，致使化藥治療十分困難，新致病菌株不斷產(chǎn)生，疫苗又難以預(yù)防該病，因而尋求具有抗菌活性的中草藥尤其是復(fù)方中草藥用于大腸桿菌病的防治是新的突破口之一。目前，中草藥治療雞大腸桿菌病成為研究熱點(diǎn)，較多文獻(xiàn)也報(bào)道單味中草藥和一些方劑對(duì)大腸桿菌病有療效，但存在發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)理不明確等問(wèn)題。所以研究中草藥抗菌作用應(yīng)綜合藥物、微生物、機(jī)體相互關(guān)聯(lián)因素，本試驗(yàn)應(yīng)用APEC標(biāo)準(zhǔn)菌株考察四味穿心蓮散水煎劑對(duì)APEC的抗菌活性，取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展、世界對(duì)中醫(yī)藥的認(rèn)可及中醫(yī)藥國(guó)際化進(jìn)程的推進(jìn)，建立和完善我國(guó)藥典和獸藥典中收錄的中草藥成方制劑的質(zhì)量控制、藥理作用機(jī)制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等方面的研究勢(shì)在必行。