干酪乳桿菌高密度發酵工藝優化

馬精陽，姜海龍，袁月明，李錦生，蘇佳興，周麗娜

（吉林農業大學工程技術學院，吉林長春 130118）

乳酸菌是大量應用到我們生產生活中的一類益生菌，安全性已經得到了多方的檢驗與認可（鄒孟琳等，2021；吳軍林等，2018）。干酪乳桿菌作為乳酸菌之一，能承受動物機體防御，進入體內后可以保持活性并促進其所在宿主的各項生理指標良性發展，提高免疫力及健康度進而提升生長性能（Deng Ziteng等，2021；陸文偉等，2019；王譽穎等，2019）。圍繞著干酪乳桿菌進行的試驗越來越多，它的各種功用也慢慢被發現，導致其需求量也隨之增加（呂佳璐等，2021；Hernandez-Mendoza等，2009）。因此，在工業生產中如何通過提高其活菌數來獲得更高的收益成為研究者倍受關注的問題。楊瑞冬等（2019）研究表明，在生產過程中菌種所需要的營養物質主要來源于發酵液，可以通過確定發酵液成分并輔以環境條件控制來達到最優發酵工藝，從而提升菌種產量（張翠綿等，2019；王丹婷等，2018；于平等，2016）。本研究通過單因素及正交試驗對發酵液成分以及發酵過程進行優化，并以活菌數作為測量指標，探究一種高密度發酵工藝，為工廠生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 干酪乳桿菌，保存于吉林農業大學實驗室。

1.1.2 試劑 葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鐵、硫酸鋅、碳酸鈉均購于國藥集團化學試劑有限公司。紅薯淀粉、蘋果、橙子、山楂、西瓜均采購于當地市場，將蘋果、橙子、山楂、西瓜榨汁后經紗布過濾，并將得到的濾液進行高溫高壓滅菌用于試驗。

1.1.3 基礎培養基 使用MRS培養基進行活菌數量測量，去除MRS培養基中的瓊脂后作為基礎液體培養基使用。

1.2 儀器設備 GR85DR型高壓蒸汽滅菌鍋：深圳市萬千科技有限公司;電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；超凈工作臺：上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司；LRH-150型恒溫生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 干酪乳桿菌菌種的活化 將實驗室保存的菌種凍干粉取出，室溫靜置5 min后在無菌操作臺以2%的接種量接種到裝有無菌液體MRS培養基的試管中，充分搖勻后在37℃恒溫箱中培養48 h得到一代菌，將得到的一代菌再次培養48 h得到二代菌進行試驗。

1.3.2 菌種發酵液成分單因素試驗 通過單因素試驗，分別研究碳源（葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨）、碳氮比（1:1、1:2、1:3、2:1、3:1）、微量元素（硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅）對菌種發酵的影響，選取試驗結果排名的前三種，作為后續正交試驗的備選成分。

發酵液各物質用量以MRS培養基作為參考，保持濃度不變的的情況下相應替換成試驗所用物質。將活化后得到的二代菌液以2%的接種量接種到試驗發酵液中，恒溫培養24 h后，使用平板涂布法檢測活菌數。

1.3.3 菌種發酵液成分正交試驗 在單因素試驗的基礎上進行三水平四因素的正交試驗，確定最佳發酵液成分組合。

表1 發酵液成分優化正交試驗因素水平

1.3.4 發酵液中添加促生長因子 在最優發酵液成分基礎上，分別添加紅薯淀粉、蘋果汁、橙汁、山楂汁、西瓜汁，測試添加后對菌種發酵的影響。

1.3.5 菌種發酵過程優化 （1）在發酵過程中補充添加最適碳氮源；（2）發酵過程中分別添加碳酸鈉和氨水，對發酵液pH進行調節并對比發酵后菌種數量。

1.3.6 發酵后活菌數的測定 取1 mL菌液，稀釋10-8后用涂布法使其均勻分布在平板培養基中，將培養基置于37℃恒溫箱中，24 h后取出讀數，數值擴大108即為原菌液中每毫升含有的活菌數值。

2 結果與分析

2.1 發酵液成分單因素試驗

2.1.1 碳源種類對菌種發酵的影響 在碳源組試驗中，分別使用了葡萄糖、乳糖、果糖和蔗糖進行菌種發酵測試，通過圖1可以看出，發酵效果依次為葡萄糖＞乳糖＞果糖＞蔗糖。其中葡萄糖的發酵效果最佳，發酵后活菌數達到8×108CFU/mL。在分類上，葡萄糖和果糖都屬于單糖，在結構式上屬于同分異構體，都可以直接參與細胞的生長代謝，但是由于其化學鍵不同，所產生的能量大小也有著些許差異，導致發酵效果出現差異。而乳糖、蔗糖屬于多糖，相比前兩種碳源其利用速度更慢，需要先經過細胞產生的分解酶進行分解后再參與細胞的生長代謝。由于在這一段培養時間內葡萄糖提供了更多的能量，導致該組活菌數數值最高。

圖1 碳源種類對菌種發酵的影響

2.1.2 氮源種類對菌種發酵的影響 在氮源組試驗中，分別使用了牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏進行菌種發酵測試，通過圖2可以看出，發酵效果排序依次為牛肉膏＞胰蛋白胨＞蛋白胨＞酵母膏。其中牛肉膏的發酵效果最佳，達到7.4×109CFU/mL。在成分上，牛肉膏當中含有多種物質，例如氨基酸、多肽類、肌酸、肌酸酐核苷酸、甘氨酸、有機酸、礦物質及維生素類，在發酵中提供氮源的同時還可以提供一些菌種所需要的其他微量物質，對菌種發酵起到了很大的促進作用。胰蛋白胨含有豐富的氮源、氨基酸等，但是其成分種類與牛肉膏相比較少，所以活菌數略低于牛肉膏。蛋白胨富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類，酵母膏可以提供氨基酸、多肽及有機酸等物質。綜合對比結果分析，牛肉膏在發酵中提供的營養物質最為全面，符合菌種快速生長的物質需求，所以其活菌數最高。

圖2 氮源種類對菌種發酵的影響

2.1.3 不同碳氮比對菌種發酵的影響 在不同碳氮比試驗中，使用相同碳氮源以不同的比例進行發酵。由圖3可以看出，發酵效果排序依次為1:2＞1:3＞2:1＞1:1＞3:1。在發酵過程中，添加的碳源最后都要轉化為葡萄糖參與菌種的生長代謝，過多的碳源會導致葡萄糖含量增加，引發“克勒勃屈利效應”，即葡萄糖濃度過高反而會抑制菌種的生長，所以在發酵中使氮源含量增加成倍數關系，可有效降低該效應的發生。同時也能提供充足的營養物質使菌種密度增加。

圖3 不同碳氮比對菌種發酵的影響

2.1.4 微量元素種類對菌種發酵的影響 在微量元素試驗中，由圖4可以看出，發酵效果排序為錳＞鎂＞鐵＞鋅。不同的微量元素可以產生不同的作用，錳可以作為超氧化物歧化酶、氨肽酶和L-阿拉伯糖異構酶等的輔因子；鎂可以作為固氮酶等的輔因子；鐵可以合成菌體組分、維持酶的活性、調節細胞滲透壓等；鋅可以作為堿性磷酸酶以及多種脫氫酶、肽酶等的輔因子。微量元素與營養物質不同，不能直接用于菌種的生長代謝，試驗中錳元素組的活菌數更高，說明在該種試驗環境下人為添加錳更符合菌種發酵的需求。

圖4 微量元素種類對菌種發酵的影響

2.2 發酵液成分正交試驗優化 由表2可以看出，在當前試驗環境條件下，對發酵效果產生影響的因素排序為碳源＞氮源＞微量元素＞碳氮比，作為菌種生命活動的主要能量及營養物質來源，在發酵液中合理使用碳源、氮源將對菌種最終的發酵密度產生主要影響。通過正交試驗確定最優條件為A2B1D2C1，發酵液基礎成分為乳糖5 g/L、牛肉膏10 g/L、硫酸鎂0.2 g/L，在此條件下發酵后菌種濃度為6.2×109CFU/mL。

表2 發酵液成分優化正交試驗結果

2.3 促生長因子對發酵的影響 在菌種生長過程中，有一些物質難以依靠本體提供，需要通過外部獲取，這一類物質包括維生素、生物素、煙酸等等。由圖5可以看出，對發酵效果影響排序為蘋果汁＞橙汁＞山楂汁＞紅薯淀粉＞西瓜汁，作為菌種生長因子來源，不同材料所含有的物質也不盡相同，例如蘋果中含有糖類、維生素類及微量元素類等等，可以在發酵過程中對營養物質進行補充。使用排序前三位的材料，在發酵液基礎成分上添加10 mL/L的混合生長因子溶液（蘋果汁：橙汁：山楂汁=3:2:1）。

圖5 不同生長因子對菌種發酵的影響

2.4 干酪乳桿菌發酵過程優化

2.4.1 發酵期間添加乳糖與牛肉膏 菌種發酵過程中，隨著時間推移，發酵液中營養物質含量隨之減少，此時補充適量的碳氮源可以維持菌種繼續生長，以提高發酵結束時的菌種密度。

通過圖6可以看出，在分別補充不同濃度的乳糖之后，發酵效果排序為0.3%＞0.4%＞0.5%＞0.2%＞0.1%。添加量超過0.3%后，菌種密度反而出現下降趨勢，可能是碳源過多導致菌種不能完全消耗其分解的產物，出現葡萄糖堆積，抑制了菌種發酵效率。因此選擇在培養24 h后向發酵液中添加0.3%的乳糖來達到補充碳源的目的。

圖6 發酵期間乳糖補充量對發酵的影響

通過圖7可以看出，在補充不同濃度的牛肉膏之后，發酵效果最好的是0.8%這一組，添加量大于0.8%時各組數據出現不穩定狀態，可能是隨著氮源含量的增加導致碳氮比相應出現變化，使得原本發酵液的發酵環境被改變，菌種的生長性能隨之波動并呈現出下降趨勢。因此選擇在培養24 h后向發酵液中添加0.8%的牛肉膏來補充氮源。

圖7 發酵期間牛肉膏補充量對發酵的影響

2.4.2 發酵期間添加碳酸鈉與氨水 干酪乳桿菌在發酵過程中，菌體會產生L型旋光性乳酸，導致發酵環境的pH逐漸降低，最終嚴重影響活菌密度，因此需要在發酵時對發酵液pH進行調節。通過圖8可以看出，添加不同濃度的碳酸鈉之后，菌種濃度出現差別，其中添加濃度為2.5%時密度最高，達到2.9×109CFU/mL。

圖8 發酵期間碳酸鈉添加量對發酵的影響

通過圖9可以看出，添加氨水濃度為4%時菌種密度最高，達到3.6×109CFU/mL。綜合對比兩組試驗，添加氨水后發酵環境更適宜菌種發酵，因此選擇在培養24 h后向發酵液中添加4%的氨水來調節酸堿度，保證菌種生長環境。

圖9 發酵期間氨水添加量對發酵的影響

3 結論

本試驗結果表明，干酪乳桿菌最優發酵工藝為：對所用材料全部進行滅菌操作后，在無氧密閉的環境內以溫度為37℃、pH為6.5、接種量為2%的初始條件進行發酵，在此條件下使用乳糖5 g/L、牛肉膏10 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、混合生長因子溶液（蘋果汁：橙汁：山楂汁=3:2:1）10 mL/L的發酵液進行恒溫無氧發酵；24 h后向發酵液中添加濃度0.3%的乳糖、0.8%的牛肉膏與4%的氨水，繼續發酵24 h后收獲菌種。在此發酵工藝條件下，收獲的菌種密度可達到2.8×1010CFU/mL。