基于穩(wěn)定氧同位素的葡萄酒摻水鑒別方法研究

朱 莉，李葉鳳，劉亞新，康天浩，譚 丹，劉敦華，張 昂

(1.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.河北省葡萄酒質(zhì)量安全檢測重點實驗室，河北秦皇島 066000；3.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北秦皇島 066000)

葡萄酒中富含多種氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。隨著全球化進(jìn)程推進(jìn)，葡萄酒行業(yè)發(fā)展迅速，市場的巨大潛力漸顯[1-2]。在利益驅(qū)動下，葡萄酒摻假現(xiàn)象時有發(fā)生，不利于葡萄酒市場穩(wěn)定發(fā)展。葡萄酒中摻水是制造假酒最常見的手段，其目的是降低酒精度或蓄意摻假。按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 15037—2006）中對葡萄酒的定義，葡萄酒中的水應(yīng)全部來自于葡萄原料，而非人為添加。因此，生產(chǎn)過程中不得外源摻水，但標(biāo)準(zhǔn)中缺少與之配套的葡萄酒中外源水的鑒別方法。目前，針對葡萄酒摻水行為，可用感官分析、可見-近紅外光譜分析[3]、氣相色譜分析[4]、高效液相色譜法分析[5]和穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜分析[6-12]等方法加以鑒別。但僅利用簡單的理化指標(biāo)或感官分析甄別葡萄酒摻水不夠準(zhǔn)確和嚴(yán)謹(jǐn)。光譜分析技術(shù)因其具有快速、無損、樣品不需預(yù)處理等優(yōu)點，常被用于葡萄酒摻偽鑒別[13-14]。有學(xué)者利用可見-近紅外光譜技術(shù)檢測了成品葡萄酒的摻水，對于發(fā)酵前摻水的鑒別研究尚未見報道。穩(wěn)定同位素技術(shù)因其能提供無法復(fù)制或偽造的獨特分子指紋，顯示出了獨特的優(yōu)勢[15]，利用穩(wěn)定同位素技術(shù)可檢測葡萄酒發(fā)酵前摻水。發(fā)展穩(wěn)定同位素技術(shù)對葡萄酒摻假鑒別具有重要意義[16-18]。

本試驗利用水平衡儀-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（EQ-IRMS）測定葡萄酒中水的δ18O，探討摻入不同δ18O特征的外源水及其摻入量對葡萄酒中水的δ18O值的影響，初步建立基于穩(wěn)定氧同位素的葡萄酒中外源水摻入的鑒別模型，旨在為我國葡萄酒摻水鑒別技術(shù)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的完善提供思路和借鑒，為推動穩(wěn)定同位素技術(shù)在葡萄酒摻水鑒別領(lǐng)域的深入研究和實際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

實驗材料：采摘自香格里拉產(chǎn)區(qū)的葡萄樣品和水。

儀器設(shè)備：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph 公司；氣相色譜儀（GC 2023），日本島津公司；氣相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀，英國Sercon 公司；水平衡制樣系統(tǒng)，英國Sercon 公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（APP260）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

通過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)實現(xiàn)水中穩(wěn)定氧同位素不同程度的分餾，制備了δ18O 值分別為-2.33 ‰（SD=0.10）、-4.35 ‰（SD=0.09）、-6.32 ‰（SD=0.03）、-8.36 ‰（SD=0.08）、-10.34 ‰（SD=0.01）、-12.33 ‰（SD=0.10）、-14.34 ‰（SD=0.05）、-16.33‰（SD=0.08）、-18.35‰（SD=0.06）的9 種外源水樣品，基本覆蓋全國不同地區(qū)自來水的δ18O范圍（-17.74‰～-3.80‰）[19]。

針對蓄意的摻水行為，向理論酒精度8.0%vol、8.5 %vol、9.0 %vol、9.5 %vol、10.0 %vol 的葡萄汁中，摻入12.0%、17.0%、22.5%、26.0%、30.5%的9種δ18O值外源水，發(fā)酵預(yù)期酒精度為7.0%vol（國標(biāo)規(guī)定葡萄酒最低酒度）的葡萄酒；向理論酒精度14.0 %vol、15.0 %vol、16.0 %vol 的葡萄汁中，分別摻入7.0%、13.0%、18.5%的9 種δ18O 值外源水，發(fā)酵預(yù)期酒精度為13.0%vol（市售葡萄酒常見酒度）的葡萄酒；針對降低酒精度的摻水行為，向理論酒精度17.0 %vol、18.0 %vol、19.0 %vol 的葡萄汁中，分別摻入5.5 %、11.5 %、15.5 %的9 種δ18O 值外源水，發(fā)酵預(yù)期酒精度為16.0%vol（普通酵母耐受的最高酒度）的葡萄酒。發(fā)酵在恒溫恒濕培養(yǎng)箱（溫度28 ℃、濕度60%RH）中完成。

1.2.2 氧同位素比值測定方法

利用EQ-IRMS 測定葡萄酒中水的δ18O，采用相對測量法表示樣品中的穩(wěn)定氧同位素值，結(jié)果以Delta(δ)符號表示。每個樣品平行測定5次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Office Excel 2019對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用Origin 2020軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵對葡萄汁中水的δ18O影響

發(fā)酵前葡萄汁中水的δ18O（δ18Osample）和發(fā)酵后葡萄酒中水的δ18O（δ18Owine）見表1。

表1 葡萄汁發(fā)酵前后水中δ18O比較

結(jié)果表明，δ18Owine較δ18Osample偏負(fù)0.03 ‰，說明發(fā)酵過程中未發(fā)生明顯的分餾效應(yīng)。酒精發(fā)酵是非常復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，研究[20]發(fā)現(xiàn)丙酮酸分解生成乙醛和二氧化碳的過程中會發(fā)生氧同位素的分餾，乙醛還原為乙醇會導(dǎo)致水中δ18O 降低。事實上，只有很小一部分乙醛會還原為乙醇。因此，發(fā)酵對葡萄汁中水的δ18O影響很小。

2.2 基于穩(wěn)定氧同位素構(gòu)建葡萄酒摻水鑒別模型

摻入不同δ18O 特征、不同摻入量的外源水后，葡萄酒中水的δ18O 值見表2。由于葡萄汁摻水前后δ18O 差值很小，無法利用常規(guī)的顯著性差異分析進(jìn)行判斷，本研究利用儀器測量精度（標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.1）作為參考值判斷葡萄酒是否摻水。葡萄酒中水的δ18O與摻水量的相關(guān)性分析見圖1。

圖1 葡萄酒中水的穩(wěn)定氧同位素值與摻水量的相關(guān)性分析

表2 葡萄酒中水的δ18O

由圖1 可知，加入較葡萄汁中水δ18O 偏正的外源水，摻水量與葡萄酒中水的δ18O 呈良好正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)加入與葡萄汁中水δ18O 相比偏負(fù)的外源水后，隨著摻水量的增加，葡萄酒中水的δ18O 逐漸偏負(fù)，摻水量與葡萄酒中水的δ18O 呈現(xiàn)明顯且良好的線性負(fù)相關(guān)。加入δ18O為-2.33‰的外源水時，擬合方程為δ18O=0.0358x-5.8632（x 為外源水含量），R2=0.999，模型可判斷至少7.0%的摻水量；加入δ18O為-4.34‰的外源水時，擬合方程為δ18O=0.0156x-5.8566，R2=0.999，模型可判斷至少13.0 %的摻水量；加入δ18O 為-6.32 ‰的外源水時，擬合方程為δ18O=-0.0052x-5.8564，R2=0.985，摻水量達(dá)30.5%時，SD 仍小于0.100，預(yù)測模型不能判斷30.5 %以下的摻水量；摻入δ18O 為-6.32 ‰的外源水與葡萄汁中水的δ18O 值（-5.83 ‰）比較接近，即使摻水量很大，仍難以鑒別；加入δ18O 為-8.36 ‰的外源水時，擬合方程為δ18O=-0.0240x-5.8734，R2=0.998，模型可判斷至少11.5%的摻水量。

加入δ18O 為-10.34‰的外源水時，擬合方程為δ18O=-0.0446x-5.8620，R2=0.999；加入δ18O 為-12.33 ‰的外源水時，擬合方程為δ18O=-0.0644x-5.8643，R2=0.999；加入δ18O 為-14.34‰的外源水時，擬合方程為δ18O=-0.0841x-5.8681，R2=0.999；加入δ18O 為-16.33 ‰的外源水時，擬合方程為δ18O=-0.1044x-5.8620，R2=0.999；加入δ18O 為-18.35 ‰的外源水時，擬合方程為δ18O=-0.1232x-5.8664，R2=0.999。當(dāng)摻入上述5 種不同δ18O 值的外源水，模型均可判斷至少5.5%的摻水量。

為驗證模型的有效性，選取摻水量為5.5%、11.5%、15.5%、22.5%、30.5%，摻入外源水δ18O為-6.32‰的葡萄酒樣本，代入擬合方程δ18O=-0.0052x-5.8564，反演估算葡萄酒摻水量，真實值與估算值的關(guān)系如表3 所示。驗證選取了擬合程度最低（R2=0.985）的擬合方程，得到樣品真實值與估算值的平均相對誤差僅為0.075，表明基于不同δ18O 特征外源水建立的摻水鑒別模型可靠性高，可以滿足定量分析葡萄酒摻水的要求。

表3 葡萄酒樣品估算結(jié)果

進(jìn)一步分析，當(dāng)δ18Osample與δ18Owater相差1.51 ‰時，模型能判斷至少13.0 %的摻水量；δ18Osample與δ18Owater相差2.50‰時，模型能判斷至少11.5%的摻水量；δ18Osample與δ18Owater相差3.53‰時，模型能判斷至少7.0 %的摻水量；δ18Osample與δ18Owater相差4.48 ‰時，模型能判斷至少5.5%的摻水量。因此，依據(jù)葡萄汁中水的δ18O 與外源水δ18O 的絕對差值，利用模型可推斷出摻水量的最低檢出限值。結(jié)果見圖2。

圖2 摻水量的最低檢出限結(jié)果分析

由圖2 可知，δ18Osample與δ18Owater的絕對差值和摻入外源水量的最低檢出限呈良好線性負(fù)相關(guān)變化，擬合方程為y=-2.7230x+17.4325（x 為δ18Osample與δ18Owater的絕對差值），R2=0.958，擬合效果良好。在實際應(yīng)用時，該預(yù)測模型對任一地區(qū)葡萄酒的摻水鑒別均具有較高的參考價值。

3 結(jié)論

本研究通過穩(wěn)定同位素技術(shù)分析摻入不同δ18O特征外源水及其摻入量對葡萄酒中水的δ18O 值的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后葡萄汁中水的δ18O 變化很小，僅相差0.03‰；摻入不同穩(wěn)定氧同位素的外源水，摻水量與葡萄酒中水的δ18O 呈良好相關(guān)關(guān)系，并針對9 種不同δ18O 的外源水，建立了9 個鑒別模型，且利用模型反演估算的摻水量與實際摻水量的平均相對誤差小于0.1；根據(jù)葡萄汁中水的δ18O 與外源水δ18O 的絕對差值，可判斷葡萄酒中外源水的最低摻入量，當(dāng)葡萄汁中水的δ18O 與外源水δ18O 相差≥4.48‰，外源水占比≥5.5%時即可實現(xiàn)對葡萄酒的摻水鑒別。以上結(jié)果證明基于穩(wěn)定氧同位素的葡萄酒摻水鑒別模型不僅可以快速鑒別葡萄酒是否摻水，還可準(zhǔn)確定量外源水摻入量，可為違反葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn)的摻水行為提供鑒別方法和手段。針對葡萄酒摻假現(xiàn)象，在不斷完善現(xiàn)有方法的同時，探索新型檢測技術(shù)依舊是未來進(jìn)一步研究的方向。隨著行業(yè)和消費者產(chǎn)品真實性意識的增強(qiáng)、企業(yè)自律性的提高、摻假鑒別方法和葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)體系的逐步完善，葡萄酒摻水問題將會逐步得到解決。