超聲輔助酶法提取山荊子果膠工藝優化及其紅外光譜特征

李澤林，沈晉如，方敏瑞，趙春燕，范江平，沈曉靜,2，3*，鄭婷婷

(1.云南農業大學 食品科學技術學院，昆明 650201；2.昆明醫科大學 云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500；3.云南農業大學 理學院，昆明 650201；4.普洱茶研究院，云南 普洱 665099)

山荊子(Malusbaccata(L.) Borkh.)又叫山丁子、林荊子、山定子和海棠果，是薔薇科蘋果屬多年生木本植物，主要分布于朝鮮、俄羅斯及我國東北、華北、西南等地區[1-2]。山荊子果實含有表兒茶素、花青素等活性成分，可用于緩解兒童排尿困難、關節疼痛和炎癥等癥狀[3]。成熟的山荊子鮮果具有酸甜適中的獨特風味以及含有大量的果膠多糖類物質[4]，其常被用來制作糕點、飲料、果酒等食品。周慧等[5]聯用均勻設計和模糊數學方法，優化了茯苓山荊子果糕的加工工藝。童觀珍等[6]采用響應面法優化了山荊子果汁飲料配方。高志霞等[7]采用正交實驗優化了山荊子葡萄復合果酒工藝。這些對山荊子食品的開發研究促進了山荊子的綜合利用。但對山荊子果膠的提取研究目前尚未見報道。

果膠是一類以D-半乳糖醛酸為主要組成成分的酸性雜多糖。因果膠具有綠色天然、無毒環保的特點被廣泛用于食品生產加工[8]。另外，果膠溶液黏度比低、流動性好，1%果膠溶液具有假塑性流體的部分特性以及良好的膠凝度，也常被作為功能性食品添加劑用于改善加工食品和調味制品的外觀、組織、口感以及生物利用度[9-10]。目前，果膠被廣泛應用于果醬、醬料、面包、飲品、果凍、軟糖等產品中[11]。

超聲輔助酶法提取技術具有提取時間短、提取率高、成本低、低溫保護熱敏性成分等優點，被廣泛應用于植物基果膠的提取[12]。本實驗擬采用響應面法優化山荊子果膠的超聲輔助纖維素酶提取工藝，并檢測其總糖含量、酯化度、乙酰化度等指標，再采用傅里葉紅外光譜表征其組成，旨在為麗江山荊子果膠的綜合開發利用以及結構初探提供一定的理論依據及實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麗江山荊子鮮果：云南省麗江市；纖維素酶(10 000 U/g)：瑪雅試劑有限公司；透析袋MD34(7 000 D)：上海源葉生物科技有限公司；AB-8大孔樹脂：河北美凱化工有限公司；三氯甲烷(AR)：重慶川東化工有限公司；正丁醇(AR)：廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器設備

SCIENTZ-48高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；H3-18K臺式高速離心機 湖南可成儀器設備有限公司；RE-2000A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SCQ-9201B超聲波提取儀 上海聲彥超聲波儀器有限公司。

1.3 果膠提取方法

將采自云南麗江的山荊子鮮果去除果葉、果柄和果核后清洗干凈，于55 ℃烘箱中烘干至含水率低于5%，粉碎，過80目篩，備用。準確稱取20 g果粉和果粉質量3%的纖維素酶，用500 mL純水充分溶解并調節pH至4.5后于55 ℃酶解90 min，沸水滅酶5 min，超聲25 min，過濾后旋轉蒸發至原體積的1/3，得到果膠提取液。加入等體積的乙醇，混勻，于4 ℃冰箱中過夜后離心(5 000 r/min)去上清液，將剩余固體真空冷凍干燥后得到粗果膠，并按照下式計算果膠提取率：

式中：m為干燥后粗果膠質量；m0為山荊子果粉質量。

1.4 果膠提取單因素實驗

1.4.1 超聲時間對果膠提取率的影響

考察超聲時間對山荊子果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量1.15%、pH 4.5、酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h、超聲溫度55 ℃和料液比1∶18，設置超聲時間分別為10，15，20，25，30 min，對山荊子果膠進行提取，計算果膠提取率。

1.4.2 酶解時間對果膠提取率的影響

考察酶解時間對山荊子果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量1.15%、pH 4.5、酶解溫度55 ℃、超聲溫度55 ℃、超聲時間25 min和料液比1∶18，設置酶解時間分別為1，1.5，2，2.5，3 h，對山荊子果膠進行提取，計算果膠提取率。

1.4.3 酶添加量對果膠提取率的影響

考察酶添加量對山荊子果膠提取率的影響：固定pH 4.5、酶解溫度55 ℃、酶解時間1.5 h、超聲溫度55 ℃、超聲時間25 min和料液比1∶18，設置酶添加量分別為果粉的1%、1.5%、2%、2.5%、3%，對山荊子果膠進行提取，計算果膠提取率。

1.5 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，運用Box-Behnken設計三因素三水平響應面實驗，并以果膠提取率為響應指標(%)，見表1。

表1 響應面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.6 理化指標檢測

參考李曉娟等[13]的苯酚-硫酸法測定果膠的總糖含量；參考Kaya等[14]的福林酚比色法測定果膠的多酚含量；參考Patience等[15]的考馬斯亮藍法測定果膠的蛋白質含量；參照國標GB 5009.3—2016中的直接干燥法測定純化果膠的水分含量；參考Chen等[16]的皂化滴定度法測定果膠的酯化度；參考Shivamathi等[17]的化學滴定法測定果膠的乙?；?。

1.7 紅外光譜檢測

準確稱取果膠樣品1 mg，采用KBr壓片法進行檢測，在500～4 000 cm-1范圍內進行掃描。

1.8 數據處理

采用Microsoft Excel 2010數據統計軟件分析處理實驗數據，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面實驗設計與分析；每組實驗均重復3次，實驗結果求平均值并以“平均值±標準差(SD)”表示。

2 結果分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 不同超聲時間對山荊子果膠提取率的影響

圖1 單因素實驗結果Fig.1 The results of single factor experiments

超聲時間對山荊子果膠提取率的影響見圖1中a。在不同超聲時間的影響下，果膠提取率呈現先上升后下降的趨勢，當超聲時間為25 min時，果膠提取率最高，為(5.93±0.13)%。當超聲時間超過25 min時，果膠提取率呈現緩慢降低的趨勢，這可能是因為超聲波具有強力的機械切割作用，長時間的作用可能使果膠被破壞，從而減少提取率。所以，選擇超聲時間25 min為最優值。

2.1.2 不同酶解時間對山荊子果膠提取率的影響

酶解時間對山荊子果膠提取率的影響見圖1中b。在不同酶解時間的影響下，在1.0～1.5 h內隨著時間的增加果膠提取率逐漸增大，當酶解時間為1.5 h時，果膠提取率最高，為(8.85±0.26)%。當酶解時間超過1.5 h時，纖維素酶已經充分作用，果膠溶出量不再增加，繼續延長酶解時間，部分水溶性果膠水解以及超聲的空化作用破壞了果膠結構,導致提取率降低。所以，選擇酶解時間1.5 h為最優值。

2.1.3 不同酶添加量對山荊子果膠提取率的影響

酶解液中纖維素酶添加量對果膠提取率的影響見圖1中c。在纖維素酶添加量為1.0%～2.5%時，果膠提取率隨著纖維素酶添加量的增加而上升，提取率達到最大值(13.60±0.16)%時所需酶添加量為2.5%；當纖維素酶添加量為2.5%～3.0%時，隨著纖維素酶添加量的增加，果膠提取率反而下降。原因可能是當纖維素添加量過多時，酶解液濃度過高，這些酶出現過飽和而相互附著的“抱團”現象，降低了整體的活性，影響了果膠的提取。所以，選擇酶添加量2.5%為最優值。

2.2 響應面實驗結果分析

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗

果膠提取響應面實驗設計與結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸統計分析結果Table 3 Regression statistical analysis results

續 表

由表3回歸分析和方差分析可知，該回歸模型是顯著的(P<0.05)。在各響應因素中，一次項C(酶添加量)的P<0.01，表明該因素對果膠得率有極顯著影響。二次項A2的P<0.05，表明超聲時間對果膠提取率有顯著影響。

模型的失擬項不顯著(P>0.05)，說明實際值與預測值之間無失擬存在，方程擬合性好，實驗誤差小。根據各因素顯著水平，結合F值大小可以判斷，各單因素對果膠提取率影響程度的主次順序為C(酶添加量)>B(酶解時間)>A(超聲時間)。以超聲時間(A)、酶解時間(B)、酶添加量(C)為自變量，以山荊子果膠得率為因變量，對各組合處理得到的果膠得率進行二次回歸分析，建立多元二次響應面回歸模型：果膠提取率=13.22-0.33A+1.49B+3.86C-0.28AB-0.77AC-2.71BC-3.14A2-1.28B2+0.31C2。

2.2.2 交互作用分析

圖2 各因素交互作用對果膠提取率影響的三維曲面和等高線Fig.2 Three-dimensional surface diagrams and contour lines of the effects of interaction of various factors on the extraction yield of pectin

響應面圖的弧度與等高線的密集程度反映了各因素作用的大小。各因素的交互作用對響應值的影響可通過等高線直觀地反映出來，等高線的形狀可以反映出各因素交互效應的強弱，等高線為橢圓形表明兩因素的交互作用對果膠提取率的影響作用顯著，當等高線呈圓形時，則表明兩因素的交互作用不顯著[18-19]。由圖2中a可知，超聲時間A和酶解時間B的交互作用響應面圖呈現了果膠提取率先增大后減小的趨勢，說明兩者對果膠提取率有影響，但是等高線呈圓形，說明兩者的交互作用無顯著差異。由圖2中b和c可知，響應曲面圖較陡峭，由圖形弧度及等高線密度可知纖維素酶添加量對果膠提取率的影響比酶解時間和超聲時間對果膠提取率的影響大，但是沒有顯著差異。交互作用分析結果與方差分析表中的結果相一致。

2.2.3 最佳工藝條件的預測與模型驗證

根據以上模型得到最佳提取工藝條件：超聲時間24.23 min，酶解時間1.27 h，纖維素酶添加量3%，理論上得到山荊子果膠提取率為17.75%。在此條件下進行3組平行實驗驗證，得到實際的山荊子粗果膠提取率為(17.70±0.28)%，與模型理論值相接近且無顯著差異，證明該數學模型優化的最佳工藝參數具有可行性和重現性。

2.3 山荊子果膠理化指標檢測結果

進一步對山荊子果膠的理化指標進行檢測，結果見表4。使用超聲輔助酶法提取的山荊子果膠總糖和多酚含量較高，分別達到了(78.59±3.76)%和(26.10±0.11)%；但是，其蛋白質含量和含水量較低，僅為(0.20±0.07)%和(3.71±0.07)%。此外，從山荊子果膠中檢測到酯化度和乙酰化度分別為(65.00±0.04)%和(15.83±0.13)%。這些結果說明該方法提取的果膠是高酯果膠并且具有一定的純度，但是還可以進一步純化。

表4 山荊子精果膠理化指標Table 4 Physicochemica lindexes of pectin from Malus baccata (L.) Borkh.

2.4 紅外光譜結果分析

圖3 山荊子果膠的FT-IR

3 結論

本研究采用超聲輔助酶法提取山荊子果膠工藝，最佳提取條件為超聲時間24.23 min，纖維酶添加量3%，酶解時間1.27 h，山荊子果膠實際提取率為(17.70±0.28)%；使用超聲輔助酶法提取的山荊子果膠總糖和多酚含量較高，分別達到了(78.59±3.76)%和(26.10±0.11)%，蛋白質含量較低，為(0.20±0.07)%；此外，紅外光譜顯示山荊子果膠是一類含有典型多糖結構的高酯果膠。本研究可為云南麗江山荊子的綜合利用和其果膠結構特性研究提供前期基礎和理論依據。