基于高通量測序揭示臭咸雞蛋及其發酵液微生物多樣性

袁宇涵，王巖，金澤林，張亮，王亮，劉云國*

(1.新疆大學 生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046；2.臨沂大學 生命科學學院，山東 臨沂 276000；3.臨沂小魯生物科技有限公司，山東 臨沂 276000)

臭咸雞蛋作為一種傳統的發酵蛋制品，產地主要集中在我國北京、山東等地。由于其獨特的風味以及易于攜帶、食用方便的特點，臭咸雞蛋深受老百姓的喜愛。臭咸雞蛋與臭豆腐、臭鱖魚等特色小吃有異曲同工之妙，都是通過自然發酵與時間相結合而產生的美味，吃后讓人流連忘返、回味無窮[1]。臭咸雞蛋主要是通過鹽、堿等不同輔料加工腌制處理而成，然而其生產方式目前只有通過家庭式小作坊來進行自然腌制，市場上還沒有形成生產臭咸雞蛋的產業鏈。隨著人們生活水平的日益提高，特色小吃逐漸引起人們的注意，為實現臭咸雞蛋的產業化，確定其發酵優勢菌種，從而闡述優勢微生物與風味之間的發展關系變得至關重要。

發酵食品通常是由原料本身及環境微生物的共同作用來賦予其獨特的風味[2]，風味是發酵食品的一個非常重要的質量屬性，它關系到消費者的接受程度，微生物群落在發酵過程中對形成風味物質起著至關重要的作用[3-4]。研究表明，在發酵過程中，許多微生物(乳桿菌、芽孢桿菌、葡萄球菌、魏斯氏菌)會在發酵過程中產生大量的風味成分[5-8]。高通量測序是一種不依賴培養的新型方法，已成為表征微生物群落的α和β多樣性的主要方法[9]，該方法結合基因組測序和生物信息學分析，能夠同時檢測優勢種屬、稀有種屬和部分未知種屬，揭示微生物群落構成，并對優勢物種進行差異分析[10]。因此，本研究采用高通量測序來揭示發酵臭咸雞蛋與發酵液中的微生物群落，分析了原料微生物與環境微生物的相關性，這些發現可能為改善臭咸雞蛋的風味和整體質量提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發酵臭咸雞蛋由中國山東濰坊地區農戶家庭自行腌制，并運往實驗室。在無菌條件下，取臭咸雞蛋樣品與發酵液樣品，分別編號為egg-1、egg-2、souse-1，并放置于-20 ℃冰箱中保藏備用。

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit：Omega公司；Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒:Life公司；2×Hieff?Robust PCR Master Mix、Hieff NGS?DNA Selection Beads:Yeasen公司。

1.2 儀器與設備

Pico-21臺式離心機 Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳拓能達科技有限公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統 上海復日科技有限公司；Q32866 Qubit 3.0熒光計 Invitrogen公司；ETC811 PCR儀 北京東勝創新生物科技有限公司；Research Plus 0.5～10 μL移液器 Eppendorf公司。

1.3 DNA的提取

采用Omega E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒提取基因組 DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒定量檢測DNA樣本濃度。

1.4 擴增及測序

以稀釋后的基因組DNA為模板，采用特異性引物341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACT-ACHVGGGTATCTAATCC)擴增16S基因的V3～V4區序列，采用引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGG-AAGTAA)和ITS2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)擴增ITS1和ITS2序列。經過兩輪擴增后用1×TAE濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，文庫濃度測定在Qubit 3.0熒光定量儀上進行，最后由生工生物工程(上海)股份有限公司在Illumina MiSeq平臺上對文庫進行測序。

2 結果與分析

2.1 物種豐富度和多樣性

2.1.1 細菌豐富度與多樣性

從3個樣品中共獲得了153 911條原始序列，見表1。經過濾后，共獲得123 713條高質量有效序列。所有樣本的覆蓋率至少為99.9%，表明測序樣本中幾乎所有的細菌都可以被檢測到。在3個樣本中，觀察到的OTUs數量為65～94個，在發酵液中樣品達到最高水平。采用Chao1指數測定各樣品的細菌群落豐度， Shannon指數估算各樣品的細菌群落多樣性。顯然，兩個雞蛋的Chao1、Ace和Shannon指數均低于發酵液。由表1可知，雞蛋的Chao1值在72.5～90之間，發酵液的Chao1值為95.2。雞蛋的Shannon指數在1.473 721～1.433 256之間，發酵液的Shannon指數為2.084 914。3個指標的變化表明，在發酵完全后，發酵液中細菌群落的豐富度和多樣性明顯高于egg-1、egg-2，表1顯示了每個樣品的分析讀數。稀釋曲線趨于平坦，反映了測序數據的合理性，見圖1中a。

表1 16S rDNA測序α多樣性分析Table 1 α diversity analysis for 16S rDNA sequencing

2.1.2 真菌豐富度與多樣性

從3個樣品中共獲得了215 834條原始序列，經過濾后，共獲得155 133條高質量有效序列，見表2。所有樣本的覆蓋率均在99.9%以上，說明測序結果可靠，樣品中的序列幾乎全部被檢測出。值得注意的是，發酵液真菌的Ace、Chao1、Shannon指數均明顯高于細菌，說明發酵液中真菌群落的豐富度和多樣性明顯高于細菌群落。隨著測序條數的增加，曲線逐漸趨于平緩，說明測序數據合理，可真實反映真菌群落的多樣性，見圖1中b。

表2 ITS測序α多樣性分析Table 2 α diversity analysis for ITS sequencing

圖1 稀釋曲線

2.2 微生物群落組成

采用擴增子測序方法進行分析。由圖2可知，在3個樣品中共鑒定出7個細菌門，其中相對豐度>0.1%的有放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)。其中egg-1、egg-2中厚壁菌門相對豐度高達91.44%和94.83%，變形菌門相對豐度為7.72%和4.24%，其余細菌門相對豐度總值不及1%。但在發酵液中，變形菌門為優勢類群，相對豐度為63.71%，厚壁菌門則占30.06%。厚壁菌門和變形菌門是雞蛋及其發酵液中的兩個主要微生物菌群，其相對豐度在93%以上。

圖2 門水平上各樣品中細菌群落的相對豐度和組成Fig.2 Relative abundance and composition of bacterial community in various samples at the level of phylum

圖3 屬水平上各樣品中細菌群落的相對豐度和組成Fig.3 Relative abundance and composition of bacterial community in various samples at the level of genus

圖4 門水平上各樣品中真菌群落的相對豐度和組成Fig.4 Relative abundance and composition of fungal community in various samples at the level of phylum

圖5 屬水平上各樣品中真菌群落的相對豐度和組成Fig.5 Relative abundance and composition of fungal community in various samples at the level of genus

在屬水平上，雞蛋與發酵液菌群種類與豐度差異較大，在不同樣品中共鑒定出79個屬。由圖3可知，雞蛋中主要優勢屬為鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)，在egg-1和egg-2中相對豐度分別達到69.51%和54.24%，而在發酵液中則為14.97%。與雞蛋相比，發酵液中鹽厭氧菌屬的含量明顯降低。鹽厭氧菌屬是一類嚴格厭氧的細菌[11]，在發酵后期，雞蛋內環境屬于厭氧發酵狀態，有利于鹽厭氧菌屬的大量繁殖，而發酵液環境復雜，可能對其產生了限制。已有文獻證明鹽厭氧菌屬在傳統腐乳、蝦醬、魚露的發酵過程中起著巨大的作用[12-14]。雞蛋中第二大優勢菌群為海藻乳酸菌(Marinilactibacillus)，相對豐度分別為17.8%和37.04%，作為嗜鹽嗜堿乳酸菌，海藻乳酸菌廣泛分布在環境、腌制肉制品與乳制品中[15-17]，值得注意的是，在發酵液中海藻乳酸菌相對豐度僅有0.06%。腸桿菌屬是常見的致病菌屬[18]，在本次研究中，egg-1和egg-2中均檢測到腸桿菌屬(Enterobacter)，而在發酵液中幾乎沒有檢測到。相對于發酵液來說，雞蛋中營養物質豐富，腸桿菌屬細菌更易通過氧化多種簡單有機化合物或發酵糖、有機酸或多元醇來獲取能量，因此，在發酵過程中對于時間的把控要格外注意，不僅追求質量的提升，更要注意健康和安全。在發酵液中鹽單胞菌屬(Halomonas)為優勢屬，相對豐度為47.17%，據報道，鹽單胞菌屬廣泛存在于水體環境中，這與我們的研究結果一致[19-20]。海桿菌屬(Marinobacter)在雞蛋中相對豐度極低，而在發酵液中作為第三大優勢菌群，相對豐度為14.27%。泰式菌屬(Tissierella)主要存在于人體胃腸道與動物糞便中[21]，在egg-1、egg-2中均沒有檢測出，是發酵液中特有的細菌群落，約占9.11%。

由圖4可知，ITS 測序分析表明，在真菌門水平上，共鑒定出8個真菌門，值得注意的是，3個樣品中子囊菌門(Ascomycota)均具有極高的相對豐度，其中egg-1中相對豐度最高，占97.37%。擔子菌門(Basidiomycota)雖然作為第二大真菌群落，但在3個樣品中最高也僅有5.47%，發酵液中擔子菌門相對豐度略高于egg-1、egg-2。

在屬水平上，共鑒定出118個屬，由圖5可知，發酵液真菌群落的豐富度和均勻度明顯高于egg-1、egg-2。3組樣品中占優勢的主要是帚枝霉屬(Sarocladium)，但相對豐度有所差異，在41.15%～70.89%之間，帚枝霉屬是一種常見的內生菌，直到最近才被認為與部分腐敗疾病的引起是低相關性的[22]，并且具有一定的生物防治潛力，可以作為一種有效的抗致病菌生物防治劑[23]。邁耶氏酵母屬(Meyerozyma)在3個樣品中均存在，但egg-1略高于egg-2和發酵液。發酵液中有孢圓酵母屬(Torulaspora)相對豐度為9.61%，而在egg-1中僅有0.27%，研究表明，酵母可以直接利用葡萄糖、果糖發酵，經歷一系列復雜的生物化學反應，這也是產生臭咸雞蛋特有氣味的原因之一。節菱孢屬(Arthrinium)和耐干霉菌屬(Xeromyces)是發酵液中獨特的微生物群落，在其余兩個樣品中均未檢測到。

圖6 微生物群落熱圖Fig.6 Heat map of microbial community

由圖6可知，熱圖顯示了3個樣品微生物群落組成和動態的差異，相對豐度用從淺色(最低相對豐度)到深色(最高相對豐度)的顏色強度來表示。綜上所述，主要優勢細菌鹽厭氧菌屬在3個樣品中均大量存在。發酵液中鹽單胞菌屬、海桿菌屬、泰式菌屬相對豐度顯著高于雞蛋。對于真菌來說，帚枝霉屬、有孢圓酵母屬、邁耶氏酵母屬在3個樣品中均具有較高的相對豐度。而畢赤酵母屬、威克漢姆酵母屬、被孢霉屬、節菱孢屬、耐干霉菌屬和枝孢屬在發酵液中表現出比egg-1、egg-2高的相對豐度。

3 結論

本研究評價了發酵臭咸雞蛋與發酵液中微生物群落動態變化。高通量測序分析結果顯示，在egg-1、egg-2中優勢細菌屬有鹽厭氧菌屬、海藻乳酸菌，其中鹽厭氧菌屬占有極高的相對豐度，為絕對優勢菌屬。優勢真菌屬有帚枝霉屬、邁耶氏酵母屬和有孢圓酵母屬。在發酵液中鹽單胞菌屬為最優勢細菌屬，海桿菌屬、泰式菌屬為其特有細菌屬。邁耶氏酵母屬、有孢圓酵母屬、畢赤酵母屬、被孢霉屬、節菱孢屬、耐干霉菌屬在發酵液中均具有一定的相對豐度，說明發酵液中微生物分布較均勻。這些結果為后續發酵臭咸雞蛋標準化、規范化的工業生產鏈及發酵用菌的篩選提供了數據支持，并有必要進一步將基因組學和代謝組學結合起來，分析發酵特征與代謝途徑之間的關系，進一步探討發酵機制。