超微粉碎對牛蒡根粉多酚及抗氧化活性的影響

陳元震， 胡昕迪， 方旭波， 黃午陽， 李 瑩， 陳小娥

(1.浙江海洋大學食品與藥學專業，浙江舟山 316022； 2.江蘇省農業科學院，江蘇南京 210014)

自然界植物中含有豐富的酚類物質，天然酚酸通常以游離態和結合態存在于植物的皮、根、木、葉和果實中[1]。大量試驗數據證明，植物中的酚類物質具有多種生物活性，在抗氧化、抗菌、抗蟲、抗病毒等方面發揮著重要作用。這類化合物包括黃酮類化合物和羥基肉桂酸等，牛蒡是這2種化合物的重要天然來源。牛蒡(ArctiumlappaL.)別稱牛蒡子(burdock)，是桔梗目菊科二年生草本植物，在亞洲已有3 000多年種植歷史。因具有保肝、抗炎和抗氧化的潛在治療特性而被作為一種營養和功能食品廣泛推廣[2]。與市面上使用的靈芝、人參等名貴藥材相比，牛蒡不僅具有多種食用和治療價值，且價格低廉易于栽培[3]。目前，在我國牛蒡根主要以菜品的形式在餐桌上呈現。為加大牛蒡的開發利用度，我們可將牛蒡根深加工制成粉末，添加到各種食品中作為功能性食品補充劑。物料利用程度和粉體理化性質密切相關，不同的生產工藝對原料的理化性質和生物活性有重要影響，粉碎工藝對粉體的特性和粒度起到關鍵作用。

超微粉碎技術是近年來一種新興的加工技術，通常被應用于生物技術、制藥工業和食品加工等領域。與傳統制備技術相比，超微粉碎技術具有更大的潛力和發展空間[4]。在加工特性方面，由于物料在短時間內被強烈粉碎，超微粉的表面發生變化，導致微粉顯現出一些粗顆粒所不具有的特性，這種特性主要表現為高溶解性、高分散性、高吸附性和高流動性[5]。在化學組成方面，超微粉碎技術提高了植物細胞壁的破碎程度，有利于存在于細胞質和細胞核的有效活性成分溶出，增加了活性物質提取效率、抗氧化性能和生物利用度[6]。此外，超微粉碎對物料物理特性，如熱力學性質、結晶度、官能團變化等也有一定影響[7]。由此可見，超微粉碎適合于方便食品和速食食品的生產。

超微粉碎技術對牛蒡根粉的影響尚未見報道。因此，本研究旨在比較超細研磨和普通粉碎后，6種不同粒徑牛蒡根粉在顆粒特征、多酚含量、抗氧化活性及生物利用度方面的區別，以期為牛蒡根粉在速食食品和有效藥物成分的應用中提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡根，購自江蘇省豐縣。氫氧化鈉、氯化鉀、磷酸鉀、碳酸氫鈉、沒食子酸、福林酚等為分析純試劑，購自百靈威化學試劑有限公司。濃硫酸、鹽酸、乙酸乙酯、甲醇等為分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。1，1-二苯基-2-苦基肼基(1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)、2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、2，4，6-三(2-吡啶基)1，3，5-三嗪[2，4，6-tri(2-pyridyl)1，3，5-triazine，TPTZ]，均購自默克生物科技有限公司。6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)，購自美國Across Organics公司。胃蛋白酶、黏膜蛋白、豬膽鹽、胰蛋白酶，均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

XDW-6A振動式細胞級超微粉碎機，購自濟南達微機械有限公司；L3-5K臺式低速離心機，購自湖南可成儀器設備有限公司；RE-52AA型真空減壓旋轉蒸發儀、SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，購自上海亞榮生化儀器廠；KQ-400DE數控超聲波清洗機，購自昆山市超聲儀器有限公司；FDU-1200真空冷凍干燥機，購自東京理化器械株式會社；AL104電子分析天平，購自梅特勒托利多科技(中國)有限公司；PHS-2C pH計，購自上海智光儀器儀表有限公司；UV-6100紫外分光光度計，購自上海美普達儀器有限公司；EUROSTAR 40 Digital高速攪拌器，購自德國IKA公司；Avanti J-26S XP落地式高速冷凍離心機，購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 選擇大小均勻、無機械損傷和病蟲害的牛蒡根(采自江蘇省徐州市沛縣，34°43′N、116°56′E)。將新鮮牛蒡洗凈，切成 1～2 cm厚薄片，60 ℃熱風干燥成牛蒡干。將牛蒡干分為2個部分，一部分使用超微粉碎機進行超細研磨，另一部分使用實驗室常用的普通研磨機研磨，具體方法見表1，兩種研磨方式得到6種牛蒡根粉。由于牛蒡根粉在空氣中易吸水結塊、褐變，需遠離潮濕和光線，存放在密封袋，存于4 ℃冰箱。

表1 牛蒡干制備方法

1.3.2 粒徑分布 粒徑分布采用干式激光衍射儀在室溫下進行測量。將1 g牛蒡根粉加入盛有 50 mL 水的燒杯中，攪拌均勻后，放入粒徑儀中進行粒徑分布測定。其中，D10、D50、D90分別代表小于粉末粒徑的10%、50%、90%的粒徑累積百分位數，D(3，2)、D(4，3)、D(2，1)和D(1，0)分別表示面積平均徑、體積平均徑、長度平均徑和數量平均徑。Span表示牛蒡根粉末粒徑的分布寬度，Φ表示細胞壁破裂率(當D50<10 μm 時，Φ=1)，以此來表征顆粒大小分布[8]，計算公式如下所示：

(1)

(2)

1.3.3 游離態、結合態酚類物質的提取 參考Juániz等的提取方法[9]，從不同粒徑的牛蒡根粉中提取游離態多酚。先采用80%甲醇提取3次，后采用6 mol/L鹽酸將上清樣品的pH值調至2.0，經乙酸乙酯重復萃取后，將萃取相在旋轉蒸發真空下濃縮干燥，甲醇復溶即得游離態多酚。保存剩下的殘渣，進行后續分析。

參考羅舜菁等的方法[10]，收集提取過游離酚后的剩余殘渣，采用2 mol/L NaOH溶液充分溶解，同時充入N2，室溫避光振蕩4 h后，采用6 mol/L HCl溶液將pH值調至2.0，離心取上清，加入等量乙酸乙酯萃取分離，重復操作5次，合并上清液在45 ℃條件下旋蒸，最后采用甲醇定容至10 mL，得到結合態多酚，-18 ℃保存。

1.3.4 酚類物質含量的測定 參考Apea-Bah等建立的Folin-Ciocalteu法[11]，稍加修改后測定總酚含量。將40 μL福林酚試劑(25%)與20 μL不同濃度梯度的沒食子酸標準品溶液(r=0.999)、空白溶液及多酚提取物溶液混合均勻，隨后加入140 μL(700 mmol/L)碳酸鈉溶液，得到200 μL混合物。并在恒溫搖床上以200 r/min的速度振蕩3 min使其混合均勻，室溫孵育30 min，在765 nm處測定吸光度。結果以1 g干物質中所含沒食子酸當量(mg GAE/g)表示。

1.3.5 體外抗氧化能力的測定 DPPH 自由基清除能力測定根據Cheng等的報道[12]，略有改變。將10 μL標準品溶液、酚類物質提取液和空白溶液分別與190 μL濃度為 65 μmol/L 的DPPH自由基溶液混合在96孔板中，在搖床上以100 r/min混勻 1 min，避光孵育 30 min 后，在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除能力按1 g干物質中所含Trolox當量(mg TE/g)表示。

ABTS自由基清除能力的測定基于楊靈光報導的方法[13]，略有變化，準備1個自由基備用溶液(7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L K2S2O8)，并在室溫下保持12～16 h，使用前用甲醇溶液在734 nm處調整備用溶液的吸光度范圍為0.70±0.02，將5 μL樣品和195 μL ABTS溶液混合孵育6 min，在 734 nm 處讀值。ABTS自由基清除能力按1 g干物質中所含Trolox當量(mg TE/g)表示。

鐵離子還原能力測定。對鐵離子還原能力的分析參考Benzie等的方法[14]，將濃度為0.3 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH值3.6)、10 mmol/L的TPTZ溶液(由40 mmol/L HCl溶解)和20 mmol/L的氯化鐵溶液按1 ∶1 ∶10的體積比充分混勻，水浴加熱至 37 ℃，得到FRAP溶液。將1 mL樣品加入至5 mL新鮮的FRAP溶液中，然后將混合物避光置于37 ℃的恒溫水域，20 min后取出，在593 nm處讀值。鐵離子還原能力以1 g干物質中所含FRAP當量(mg FEAC/g)表示。

1.3.6 體外模擬口腔、胃、腸消化 體外消化模擬是由Dong等的方法[15]進行修改而成。粉末的體外消化一般經過三步，開始于口腔，接著是胃，最后是腸道階段。模擬的唾液、胃液和腸液是由相應的消化酶、水、電解液等配制而成。在口服階段，將1 g牛蒡根粉末按照1 g ∶5 mL比例與水、氯化鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、尿素和黏膜蛋白等混合，用1 mol/L HCl將混合物酸化至6.8，并在37 ℃水浴中攪拌 10 min，離心取上清液，-20 ℃儲存；在胃步驟中，將口腔食糜與水、CaCl2和豬胃蛋白酶混合，用 3 mol/L HCl將混合物的pH值降至3.0，然后孵育攪拌2 h，離心取上清液，-20 ℃儲存；在腸道步驟中，將胃食糜與水、CaCl2、膽汁液和胰蛋白酶混合，加入1 mol/L NaOH，將混合物的pH值提高至7.0，攪拌2 h。相同的消化條件下，加入空白組(不含牛蒡根粉)，以糾正消化液、酶和液體的干擾。

1.3.7 多酚化合物的體外釋放度 參考李夢杰等的方法計算牛蒡根多酚(BRPP)的生物可及性，消化后酚類物質的生物可及性按公式(3)計算：

(3)

式中：ADS為消化后的樣品量；UNS為BRF未消化的樣品量。

1.4 數據處理與分析

本研究中每個試驗均重復進行3 次，采用Microsoft Excel 2019統計數據、SPSS 25.0分析數據差異的顯著性，P<0.05表示差異顯著；用Origin 2019 軟件作圖，結果表示為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 粒度分析

大小在0.000 001～100 mm間的微小固體顆粒被劃分為超細粉，顆粒工藝學認為從顆粒系統的角度描述食品粉末的基本特性是進行其他研究的基礎[16]。本研究先從粒徑分布方面對牛蒡根粉進行初步探討，粒度分布通常是指粉末樣品中不同粒徑顆粒在顆粒總量中的占比，采用激光粒徑分析儀得到不同研磨時間的牛蒡根粉粒徑。由圖1可知，粒徑分布隨著研磨時間增長更為集中，為進一步了解粒徑分布，我們總結了6個樣品的D10、D50、D90。由表2可知，經超微粉碎的牛蒡根粉的粒徑遠小于經普通研磨的牛蒡根粉，且超微粉碎后粉末的粒徑隨著研磨時間的增加而減小，BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-5和BP-6的D90粒徑分別為14.16、48.60、98.18、133.70、168.00、360.10 μm，同時粉末的D10、D50、D(3，2)、D(4，3)、D(2，1)、D(1，0)均有與之相同的變化趨勢。

表2 牛蒡根粉的粒徑參數

跨度值(Span)、Φ和比表面積亦可以反映粉末的基本特性，由表3可知，Span表示粒徑分布的寬度，是描述粒徑分布的另一個重要參數，Span越小，表示粒徑分布均勻[17]。與其他粉末相比，BP-1的Span為2.42，數值最小，說明顆粒更加均勻，且 BP-1 的粒徑分布范圍比其他粉末更接近于高斯分布，但從總體上看，6種樣品的跨度值無明顯規律，說明超微粉碎雖可以減小粉末粒度值，但在未達到一定的粉碎時間時，部分顆粒粉碎不夠均勻，Span與粒徑無關，只能反映顆粒的均一性[18]；另一方面Φ隨粒徑減小而增加最高可達1.9，說明超微粉碎可破壞牛蒡根的細胞壁，增加活性物質的溶出；此外，比表面積是超細粉體的重要表征指標之一，隨著粒徑的減小，牛蒡根粉的比表面積從 79.54 m2/kg 迅速增加至593.7 m2/kg，BP-1的比表面積是BP-6的7.46倍，說明超微粉碎對食品粉末的表面性能有顯著影響，此結果對粉末的吸附能力、水合作用、溶解度、抗氧化活性、生物利用度等其他性能的研究奠定了基礎[7]。

表3 牛蒡根粉末的基本特征

2.2 超微粉碎對BRPP含量的影響

酚類化合物主要以結合態和游離態2種形式存在于牛蒡根中，結合酚常規提取不易溶解，且咀嚼、酸性環境和消化酶都不會使其從食物基質中顯著釋放出來[19]，因此多數學者忽略了結合酚部分。Kroon等已證明結合酚受到結腸微生物菌群的廣泛轉化，會表現出抗氧化和抗增殖等活性[20]。本研究主要探索經超微粉碎后游離酚、結合酚和總酚的含量變化。由表4可知，超微粉碎后6種粉末的游離酚、結合酚和總酚的含量均隨著粒徑的減小而顯著增大(P<0.05)，與BP-6相比，BP-1中游離酚、結合酚和總酚的含量增加最為明顯，分別增加了23.47%、30.26%、24.87%。超微粉碎加工技術明顯增加了牛蒡根中不同狀態BRPP的溶出率和釋放量，趙萌萌等報道的超微粉碎對青稞麩皮粉末中酚類物質含量的影響中也得到相似結論[21]。一方面隨著粒徑的減小，Φ增加，牛蒡根的細胞壁遭到破壞，降低對傳質的阻力，提高溶劑輸注效率，同時改變纖維結構，釋放或暴露基質中結合態多酚[17，22]；另一方面，粉末的比表面積增大，這增大了提取溶劑和粉末的接觸面積，使提取速率增高，提取量增大。但衛子顏等的研究表明，隨著粒徑的減小，米糠結合酚的含量出現先增加后減小的趨勢，這可能隨著超微粉碎時間的增加，劇烈的機械化作用和熱效應致使細胞壁間的共價鍵和非共價鍵斷裂，從而導致結合酚含量損失[23]。而本研究超微粉碎過程采用循環冷水降溫模式，且控制超微粉碎時間低于30 min，所以并未出現結合酚含量降低的情況。

表4 超微粉碎處理后的牛蒡根中酚類物質含量

2.3 超微粉碎處理對BRPP抗氧化活性的影響

考慮到研磨過程中酚類各組分化合物的變化，深入評價超微粉碎后BRPP的生物活性尤為重要。對一種物質抗氧化活性的綜合評價需要2種或2種以上的分析方法[24]。本研究采用DPPH、ABTS和FRAP清除試驗來分析牛蒡根酚類提取物的活性，由圖2可知，在3種抗氧化評價體系中，6種不同粒徑BRPP均有明顯抗氧化活性，且與粒徑的大小有顯著關系(P<0.05)。結合態和游離態多酚的抗氧化性均隨牛蒡根粉粒度的減小而逐漸增大，其中，BP-1的粒徑最小，清除自由基的能力也最高，相較于BP-6，BP-1中游離酚和結合酚的DPPH自由基清除力分別提高28.07%、22.15%；ABTS自由基清除力分別提高了36.78%、32.42%；鐵離子還原能力也分別提高34.31%、27.13%。葉秋瑩等在分析超微粉碎對紅茶粉抗氧化性能的影響時也得到相似趨勢[25]；究其原因，一方面天然植物的抗氧化能力在很大程度上取決于植物化合物的有效性[17]，超微粉碎使得多酚釋放增強，提取率增加，從而增強了超細粉的抗氧化能力；另一方面，高比表面積微觀結構導致水溶性增加，提高了粉末的溶解能力，致使水溶性化合物的溶出率增加，如易溶于水的多糖類物質，這間接促進了超細粉抗氧化活性的增強。這與Zhang等的研究結論[17]相符合。由此可見，超微粉碎可應用于大規模加工與牛蒡根相關的功能性食品。

2.4 BRPP含量與抗氧化活性之間的相關性分析

BRPP含量和抗氧化性均隨著粒徑的減小而增大，為進一步明確BRPP含量與抗氧化活性的關聯，分析了各變量間的相關性。由表5可知，BRPP的含量與3種抗氧化活性評價指標呈極顯著正相關(P<0.01)，游離酚的相關系數分別為0.994、0.996、0.994，結合酚的相關系數分別為0.975、0.960、0.985，即BRPP含量越高，其自由基清除能力越強。BRPP具有抗氧化活性，直接說明其含有豐富的抗氧化活性化合物。

表5 牛蒡根中酚類物質含量與體外抗氧化活性的相關性分析

2.5 體外模擬胃腸消化過程中牛蒡總酚的含量及釋放度

酚類物質的吸收利用率與多種因素有關，食品加工方式對食品結構進行修飾，這會對植物次生代謝物的釋放、吸收和轉化等產生影響[26]。由于結合酚不能在消化中溶出，本研究主要探索超微粉碎對經消化后游離酚的含量和生物利用率的影響。由表6可知，牛蒡根中多酚含量在口腔、胃、腸中呈現出先增大后減小的趨勢，這與Herrera-Balandrano等研究的消化對牛蒡根酚類物質的變化趨勢[27]相一致。胃消化階段酚類物質明顯升高，說明較低的pH值環境容易使牛蒡根中酚類物質與碳水化合物、蛋白和多糖形成的穩定復合物分離[28]；腸消化階段酚類物質含量發生下降，說明采用酶進行的消化模型會對酚類物質造成破壞；進一步分析超微粉碎對BRPP生物可及性的結果發現，對比不同粒徑粉末的同一消化階段，BRPP的含量都隨著粒徑的減小而顯著增加(P<0.05)，BP-1～BP-5計算得到的BRPP生物可接受率較BP-6分別提高20.08%、17.75%、13.84%、9.81%和8.01%，說明超微粉碎可減弱細胞壁的物理阻隔、打破食物基質的結合，有效提高BRPP的生物利用率。

表6 體外口腔胃腸消化后牛蒡根中酚類物質的釋放

3 結論

本試驗采用超微粉碎技術和普通粉碎技術制備牛蒡根粉，研究了不同粒徑對牛蒡根粉模擬消化前后多酚含量和其抗氧化活性的影響。結果表明，超微粉碎的粒徑隨時間增加顯著降低，當時間為 30 min 時，粒徑最小，為14.16 μm，此時牛蒡根粉的酚類物質含量最多、抗氧化活性最強，生物利用度最高，此外酚類含量和其抗氧化活性呈顯著正相關，表明超微粉碎后的粉末的化學性能更好，當與其他粉末添加劑混合時，具有更高的潛力，發揮最大的作用。