寧夏釀酒葡萄不同子產(chǎn)區(qū)土壤細(xì)菌群落特征對比及其影響因子分析

陳曉娟， 李 明

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021； 2.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021；3.寧夏大學(xué)葡萄與葡萄酒研究院，寧夏銀川 750021)

土壤是葡萄栽培的關(guān)鍵因素，提供給葡萄生長發(fā)育的必要營養(yǎng)條件。土壤類型、肥力、微生物、溫度、水分等均能影響植株根系的生長和吸收功能。土壤微生物菌群組成及結(jié)構(gòu)的變化與土壤養(yǎng)分含量相關(guān)[1]。 微生物群落分布也是土壤肥力狀況的體現(xiàn)，通過制約土壤活性影響根系對養(yǎng)分的吸收利用[2]，從而對土壤養(yǎng)分的有效性起間接影響作用[3]。據(jù)調(diào)查，土壤的養(yǎng)分狀況和土壤中的微生物含量成正比關(guān)系，在做土壤檢測時，通常會將微生物群落特征作為重要的評判標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。有研究將土壤微生物區(qū)系及多樣性作為生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的一個重要評價指標(biāo)[6]。目前，有關(guān)土壤微生物的研究已經(jīng)成為土壤學(xué)研究最活躍的領(lǐng)域之一。西班牙、法國、美國等已對其本土的土壤微生物做了廣泛研究[7]。自然環(huán)境中僅有約1%甚至更少的微生物具有可培養(yǎng)性[8]，利用傳統(tǒng)技術(shù)對土壤微生物進行研究已不能滿足微生物資源的開發(fā)和利用。高通量測序技術(shù)是近年來應(yīng)用最普遍的新一代測序技術(shù)，具有高通量、高靈敏度和高準(zhǔn)確性等特點[9]，為全面認(rèn)識土壤微生物提供了新的契機[10-11]。

賀蘭山東麓地處寧夏銀川平原西部邊緣(37°43′～39°23′N，105°45′～106°47′E)，賀蘭山沿山以東涵蓋了石嘴山、銀川、吳忠3市，屬中溫帶干旱氣候區(qū)。賀蘭山東麓憑借其優(yōu)越的地理位置和氣候條件，成為中國重要的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，也是世界最佳釀酒葡萄生態(tài)區(qū)之一。至2020年，在賀蘭山東麓形成百萬畝葡萄種植長廊，大量荒漠草原開墾為葡萄種植地，地表覆被發(fā)生改變，開墾后形成的土壤的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)也都發(fā)生了極大的變化[7]。本試驗通過測定甘城子、立蘭、玉泉營、天得4個釀酒葡萄子產(chǎn)區(qū)的代表性酒莊葡萄園土壤的理化性質(zhì)，對比分析不同產(chǎn)區(qū)土壤的養(yǎng)分差異；基于Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，分析4個子產(chǎn)區(qū)葡萄園土壤的微生物群落特征，揭示不同產(chǎn)區(qū)的細(xì)菌群落特征，以期為賀蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)土壤微生物資源庫的建設(shè)以及葡萄根際微生物資源的篩選和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

以賀蘭山東麓的4個釀酒葡萄子產(chǎn)區(qū)代表性酒莊葡萄園土壤為研究對象。采樣地分別為甘城子(GCZ)、立蘭(LL)、玉泉營(YQY)、天得(TD)產(chǎn)區(qū)。甘城子產(chǎn)區(qū)(38°08′54″ N，105°58′37″ E)，位于吳忠市青銅峽市葉甘公路與233鄉(xiāng)道交匯處北路東，海拔1 123 m，土壤為普通灰鈣土；立蘭酒莊(38°27′38″ N，105°58′20″ E)，位于銀川市永寧縣閩寧鎮(zhèn)原隆村，海拔1 148 m，土壤為礫質(zhì)灰鈣土；玉泉營西夏王酒莊(38°25′59″ N，106°06′04″ E)，位于銀川市永寧縣玉泉大街，海拔1 092 m，土壤為風(fēng)沙土；紅寺堡天得酒莊(37°32′09″ N，106°09′16″ E)，位于吳忠市紅寺堡區(qū)新莊集鄉(xiāng)西川村，海拔1 403 m，土壤為黃綿土。

1.2 供試材料

分別采集賀蘭山東麓甘城子、立蘭、玉泉營、天得釀酒葡萄園這4個區(qū)域的土壤。葡萄品種為3年生赤霞珠(Cabernet sauvignon)。取樣均在2020年9月進行，采集葡萄根際0～20、20～40 cm土層土壤。隨機選取3棵葡萄樹，每個采樣點采取2組土樣并做標(biāo)記，采土過程避免采取石塊或大塊的土壤。將采取的不同土樣放置冰盒低溫運回實驗室，采用1.00、0.25 mm孔徑的篩子過篩，將篩過的土樣分成2組，一組置于-20 ℃冰箱中保存，用于土壤細(xì)菌群落多樣性測定；另一組自然風(fēng)干，用于理化性質(zhì)的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定 將風(fēng)干后的土壤樣品進行理化性質(zhì)的測定：使用pH計測定pH值，使用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，采用重鉻酸鉀容量法-水合熱法測定有機質(zhì)含量，采用NaOH堿解-擴散法測定有效氮含量，采用火焰光度計法測定有效鉀含量，采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定有效鉀含量[12]。

1.3.2 土壤DNA提取 采用Mo Bio Power Soil DNA Isolation Kit (Carlsbad，USA) 試劑盒進行土壤中微生物原基因組總 DNA 的提取[13]。將提取的DNA作為模板進行下一步擴增。

1.3.3 PCR擴增 采用細(xì)菌16S rDNA V4擴增通用引物進行目標(biāo)基因PCR擴增，細(xì)菌引物為515F(5′-G T G C C A G C M G C C G C G G T A A-3′)和806R(5′-G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T-3′)[14]。

1.3.4 土壤細(xì)菌群落的測定 采取 Illumina Miseq 高通量測序，獲得土壤樣品的豐度、α多樣性指數(shù)、群落結(jié)構(gòu)和群落組成差異。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 19.0軟件Duncan’s法進行單因素方差分析及Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

4個子產(chǎn)區(qū)葡萄根際0～20、20～40 cm土層土壤的化學(xué)性質(zhì)見表1。在葡萄根際土壤0～20 cm土層范圍中，GCZ產(chǎn)區(qū)土壤的pH值最大，YQY產(chǎn)區(qū)土壤的電導(dǎo)率值最大(P<0.05)，YQY、TD產(chǎn)區(qū)土壤的有機質(zhì)含量顯著大于其他產(chǎn)區(qū)(P<0.05)，YQY產(chǎn)區(qū)土壤全氮含量亦大于其他產(chǎn)區(qū)，有效氮含量4個產(chǎn)區(qū)無明顯差異，TD產(chǎn)區(qū)有效磷含量最大，GCZ產(chǎn)區(qū)有效鉀含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)(P<0.05)。在葡萄根際20～40 cm土層土壤范圍中，GCZ產(chǎn)區(qū)的pH值顯著高于其他產(chǎn)區(qū)(P<0.05)，LL、TD產(chǎn)區(qū)電導(dǎo)率值顯著高于其他2個產(chǎn)區(qū)(P<0.05)，LL產(chǎn)區(qū)有機質(zhì)含量在4個產(chǎn)區(qū)中較高，全氮含量YQY產(chǎn)區(qū)最高且顯著高于其他產(chǎn)區(qū)(P<0.05)，有效氮含量是LL產(chǎn)區(qū)的最高，TD產(chǎn)區(qū)有效磷含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)，GCZ產(chǎn)區(qū)有效鉀含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)(P<0.05)。通過對比，0～20 cm土層土壤的養(yǎng)分含量普遍高于20～40土層。

表1 不同產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤化學(xué)性質(zhì)對比分析

2.2 土壤細(xì)菌群落特征

2.2.1 不同產(chǎn)區(qū)的土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)分析 ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)表示群落豐度，指數(shù)越高說明群落的豐富度越大；Shannon指數(shù)可以用來估計樣本群落的多樣性，經(jīng)常與Simpson指數(shù)一起用于反映α多樣性指數(shù)，這2個指數(shù)越高表明微生物群落多樣性越高。表2顯示，賀蘭山東麓4個產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤0～20、20～40 cm土層的測序覆蓋率在98.23%～98.63%之間，說明該測序樣本的可信度較高。在葡萄根際土壤0～20 cm土層中，GCZ產(chǎn)區(qū)的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)最大，說明在GCZ產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤0～20 cm土層中細(xì)菌群落豐富度較大。GCZ產(chǎn)區(qū)的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)在4個產(chǎn)區(qū)中最大。在葡萄根際土壤20～40 cm土層中，GCZ產(chǎn)區(qū)與TD產(chǎn)區(qū)的ACE指數(shù)、 Chao1指數(shù)較大， TD產(chǎn)區(qū)的Shannon指數(shù)顯著大于其他產(chǎn)區(qū)，該產(chǎn)區(qū)的Simpson指數(shù)也比其他產(chǎn)區(qū)大，說明TD產(chǎn)區(qū)細(xì)菌群落的多樣性及豐富度較高。

表2 不同產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤的細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.2.2 不同產(chǎn)區(qū)細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)組成 由圖1可知，在0～20 cm土層中，細(xì)菌豐富度較高的10個門類從高到低依次為變形菌門(Proteobacteria)、未知菌門(unidentified_Bacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、黏菌門(Myxococcota)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)。其中變形菌門(Proteobacteria)是葡萄根際土壤0～20 cm土層中的最優(yōu)勢菌門，GCZ、LL、YQY、TD這4個產(chǎn)區(qū)相對豐度分別為20.89%、24.34%、17.33%、25.88%；同時還在根際土壤測得大量未知門類的菌，其相對豐度分別為20.83%、23.33%、19.10%、16.65%；其次是放線菌門、酸桿菌門等，都占有一定的比例。

由圖2可以看出，賀蘭山東麓4個釀酒葡萄子產(chǎn)區(qū)在葡萄根際土壤20～40 cm土層中排名前十的細(xì)菌菌門依次是變形菌門(Proteobacteria)、未知菌門(unidentified_Bacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸酐菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)、黏菌門(Myxococcota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、厚壁菌門(Firmicutes)、未知古菌門(unidentified_Archaea)。最優(yōu)勢菌門仍為變形菌門(Proteobacteria)，GCZ、LL、YQY、TD這4個產(chǎn)區(qū)相對豐度分別為19.05%、22.41%、32.35%、22.78；其次是未知菌門，其相對豐度分別為28.7%、17.62%、18.96%、18.14%；放線菌門相對豐度分別為10.98%、23.77%、9.84%、15.09%。

2.2.3 不同產(chǎn)區(qū)細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)組成 由圖3可知，在葡萄根際土壤0～20 cm土層中相對豐度排名前十的屬分別為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、鏈霉菌屬(Steroidobacter)、MND1屬、幽門螺菌屬(RB41)、Dongia、斯科曼氏屬(Skermanella)、海洋伍斯菌(Woeseia)、未知類菌門(unidentified_Actinomarinales)、農(nóng)研絲桿菌屬(Niastella)、Clostridium_sensu_stricto_1。優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，在TD產(chǎn)區(qū)相對豐度最大，為4.37%，其余3個產(chǎn)區(qū)的相對豐度分別為：GCZ 1.81%、LL 1.32%、YQY 1.75%；其次優(yōu)勢菌屬為鏈霉菌屬，GCZ、LL、YQY、TD這4個產(chǎn)區(qū)相對豐度分別為2.44%、2.01%、0.80%、2.19%。

如圖4所示，賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤20～40 cm土層中較高10個屬的細(xì)菌分別為MND1屬、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、節(jié)核細(xì)菌屬(Arthrobacter)、未知類菌門(unidentified_Actinomarinales)、幽門螺菌屬(RB41)、Chryseolinea菌屬、鏈霉菌(Streptomyces)、芽孢菌(Bacillus)、Pontibacter、幾丁質(zhì)噬菌(Chitinophaga)。其中，MND1為最優(yōu)勢菌屬，在GCZ、LL、YQY、TD這4個產(chǎn)區(qū)相對豐度分別為1.78%、1.76%、2.74%、3.42%，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)相對豐度分別為0.70%、1.00%、2.97%、2.63%，節(jié)核細(xì)菌屬(Arthrobacter)相對豐度分別為0.70%、4.81%、2.37%、1.28%。

2.3 土壤理化性質(zhì)與優(yōu)勢細(xì)菌群落門水平的相關(guān)性分析

表3表明，不同產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤2個土層中，變形菌門與pH值、電導(dǎo)率值等呈負(fù)相關(guān)，與全氮、有效磷含量呈正相關(guān)；未知菌門與電導(dǎo)率值與呈顯著正相關(guān)，與有效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)；放線菌門與電導(dǎo)率值、全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)；酸桿菌門與有機質(zhì)含量及全氮含量呈極顯著正相關(guān)；擬桿菌門與pH值、有效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與電導(dǎo)率值、有效鉀含量呈極顯著正相關(guān)；綠彎菌門與土壤pH值呈極顯著正相關(guān)。

表3 不同產(chǎn)區(qū)葡萄園土層土壤理化性質(zhì)與優(yōu)勢細(xì)菌門相對豐度Pearson相關(guān)性分析

3 討論

3.1 賀蘭山東麓不同子產(chǎn)區(qū)土壤理化性質(zhì)分布特征分析

土壤養(yǎng)分含量對植株的生長具有重要作用[15]。本研究對賀蘭山東麓釀酒葡萄4個子產(chǎn)區(qū)葡萄根際 0～20、20～40 cm土層土壤的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示，玉泉營、天得產(chǎn)區(qū)的有機質(zhì)與全氮含量較高，而有機質(zhì)含量是土壤肥力的重要指標(biāo)[16]，因此玉泉營產(chǎn)區(qū)葡萄根際0～20 cm土層土壤肥力較高，天得產(chǎn)區(qū)20～40 cm土壤肥力較高。該結(jié)果源于賀蘭山東麓不同果園施肥量有差異[17]。有研究表明，葡萄最適宜的土壤pH值為 6.5～7.5[18]，本研究所測pH值為8.12～9.00，由此可見4個產(chǎn)區(qū)的土壤堿性都比較強，不利于葡萄植株生長。甘城子產(chǎn)區(qū)土壤的有效氮、有效鉀含量在4個產(chǎn)區(qū)中較高，這是由土壤質(zhì)地的不同及葡萄栽培過程中養(yǎng)分管理的差異所致[17，19]。

3.2 賀蘭山東麓不同子產(chǎn)區(qū)土壤細(xì)菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)組成及影響因子

本研究基于高通量測序分析賀蘭山東麓不同土壤層細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果顯示，測序覆蓋率為98.23%～98.63%，在測序具有可信度的情況下，得出4個釀酒葡萄子產(chǎn)區(qū)葡萄根際0～20 cm土層土壤中，甘城子產(chǎn)區(qū)根際土壤的細(xì)菌群落豐富度及多樣性相對較高。有研究表明，有效鉀對α多樣性指數(shù)的影響最大[20]，土壤中K+有利于鹽漬化土壤作物和微生物的生長，但是含量過高會產(chǎn)生鹽害效應(yīng)[21]。而本研究測得在葡萄根際20～40 cm土層土壤中，天得產(chǎn)區(qū)的細(xì)菌群落豐富度及多樣性指數(shù)最大，可能是因為天得產(chǎn)區(qū)的有效鉀含量處于較合適范圍。有機質(zhì)也可以提高土壤微生物的多樣性，可以起到穩(wěn)定土壤微生態(tài)的作用[22]。因此，建議葡萄園適量施用生態(tài)有機肥，從而有效調(diào)控細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，促進葡萄園微生物的多樣性。

土壤理化性質(zhì)和微生物相互影響，與植株共享一個土壤生態(tài)系統(tǒng)[23]。賀蘭山東麓4個釀酒葡萄子產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢菌屬有MND1菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、節(jié)核細(xì)菌屬，優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門，這與周柳婷等的研究結(jié)果[24-25]一致。研究表明，影響細(xì)菌群落特征的主要因子是pH值[26]，且大多數(shù)細(xì)菌最適pH值在6.5～7.6之間[27]。本研究中pH值與大多數(shù)細(xì)菌門類呈負(fù)相關(guān)。通常變形菌門為多數(shù)鹽堿土壤地的優(yōu)勢菌門[26]，本研究測得變形菌門為4個產(chǎn)區(qū)最優(yōu)勢菌門，這與李潤根等研究結(jié)果[28-29]一致。變形菌門中存在尿素酶，可以促進尿素分解，固定土壤中的氮素，參與土壤物質(zhì)循環(huán)[30]。變形菌門在玉泉營、天得產(chǎn)區(qū)的相對豐度相比其他產(chǎn)區(qū)高，相對應(yīng)地，玉泉營、天得產(chǎn)區(qū)土壤中全氮含量也較高，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，全氮含量與變形菌門呈正相關(guān)，與羅旦等的研究結(jié)果[31]一致。放線菌門在立蘭產(chǎn)區(qū)的相對豐度較其他產(chǎn)區(qū)高。相關(guān)研究表明，酸桿菌門細(xì)菌可以編碼纖維素酶、淀粉水解酶的基因序列，酸桿菌門可以降解動植物殘體產(chǎn)生有機質(zhì)等養(yǎng)分，提高土壤肥力[32]。本試驗中酸桿菌門在玉泉營 0～20 cm土層土壤中相對豐度為13.90%，相比其他產(chǎn)區(qū)最大；天得產(chǎn)區(qū)在20～40 cm土層土壤中相對豐度為11.56%，相比其他產(chǎn)區(qū)大；而Pearson相關(guān)性分析得出，有機質(zhì)含量與酸桿菌門呈極顯著正相關(guān)，在玉泉營、天得產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤中較高，與隋夕然等的研究結(jié)果[33]一致。

4 結(jié)論

對比賀蘭山東麓4個釀酒葡萄子產(chǎn)區(qū)的土壤養(yǎng)分含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤養(yǎng)分均存在差異。其中，玉泉營產(chǎn)區(qū)土壤肥力相對較高，4個產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤均偏堿性。

不同產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)分析表明，各產(chǎn)區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性較大。甘城子、天得產(chǎn)區(qū)細(xì)菌群落的多樣性及豐富度相對較高。

賀蘭山東麓4個釀酒葡萄子產(chǎn)區(qū)土壤的優(yōu)勢菌門為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門，優(yōu)勢菌屬有MND1菌屬、Sphingomonas菌屬、Arthrobacter菌屬。不同產(chǎn)區(qū)葡萄根際土壤理化性質(zhì)與優(yōu)勢菌門的Pearson相關(guān)性分析表明，全氮含量是影響變形菌門的重要因子；有機質(zhì)與全氮含量是影響酸桿菌門的重要因子；pH值、有效磷含量、電導(dǎo)率值、有效鉀含量是影響擬桿菌門的主要因子；pH值是影響綠彎菌門的主要因子。