ZEA對大鼠睪丸支持細胞線粒體損傷和細胞凋亡的影響

聞 丹

（靖江市生祠畜牧獸醫站，江蘇 靖江 214500）

1 玉米赤霉烯酮研究進展

玉米赤霉烯酮由鐮刀菌屬所產生，是一種具有雌激素樣的代謝產物，它是一種非甾體雌激素類霉菌毒素，是重要農作物的常見污染物之一。大部分地區都受到不同程度的ZEA污染，ZEA的分布遍布全球，涉及玉米、小麥、大麥、燕麥、高粱、大米等多種農作物。它的耐熱性比較強，在110℃的高溫下處理1h才會被完全破壞，其結構與哺乳動物的激素β-雌二醇相似，能和雌激素受體結合，引起動物高雌激素癥狀。玉米赤霉烯酮的危害在臨床上最為常見的是會影響動物的生殖系統，導致動物繁殖障礙，給畜牧業發展帶來了損失。

2 睪丸支持細胞的研究進展

睪丸支持細胞又稱Sertoli細胞，它位于睪丸的曲細精管內皮，支持細胞包圍著精原細胞和其他生精細胞，是與生精細胞直接接觸的體細胞，其緊密連接會形成血睪屏障，保護精原細胞不遭受外界的侵擾。Sertoli細胞也可以吞噬凋亡的生精細胞，影響精子的成熟。

3 玉米赤霉烯酮與線粒體損傷

線粒體是細胞活力、生存和死亡的調解中心，其結構與功能異常會導致細胞功能的紊亂。眾多研究表明ZEA具有雌激素樣活性，通過與雌激素受體結合之后，會引發各類雌激素樣作用，使得動物生殖障礙[1]。

4 研究目的及意義

玉米赤霉烯酮會對動物繁殖產生一定的影響，已經有多位學者證實了其對雌性動物會出現生殖細胞凋亡、周期紊亂、早熟等現象。本試驗為了探究ZEA對睪丸支持細胞線粒體損傷的影響，使用不同濃度的ZEA處理大鼠原代睪丸支持細胞24h后，分別用CCK-8法測定細胞活率，透射電鏡觀察染毒后超微結構的損傷情況，免疫熒光法及流式細胞術檢測ZEA對線粒體的影響程度和凋亡率。這對揭示ZEA致睪丸支持細胞線粒體損傷的機制具有重要意義，為進一步研究玉米赤霉烯酮致睪丸支持細胞生殖毒性的機理提供理論依據。

5 材料與方法

5.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠（16～18日齡），購于揚州大學比較醫學中心。

5.2 主要試劑與儀器

DMEM/F-12 Gibco，美國

胎牛血清 Hyclone，美國

細胞凋亡雙染試劑盒 BD，德國

胰蛋白酶 Amresco，德國

Ⅱ型膠原酶、ZEA標準品 Sigma，美國

FACS Aria型流式細胞儀 BD，美國

二氧化碳培養箱 Thermo，美國

CM-100透射電子顯微鏡 PHILIPS，荷蘭

5.3 試劑配制

（1）PBS的配制：分別稱取KH2PO4 0.5g，KCl 0.5g，Na2HPO4·12H2O 7.25g，NaCl 20g，然后用去離子水（DDW）混勻定容至500ml，配制成濃度為5%的母液并進行過濾除菌，終濃度為1%。

（2）0.5%膠原酶溶液的配制：稱取I型膠原酶0.02g、BSA 0.04g，加入PBS混勻定容至20ml。0.22μm過濾除菌。

（3）0.25%胰蛋白酶溶液的配制：稱取胰蛋白酶 0.05g，加入PBS混勻定容至20ml，0.22μm過濾除菌。

（4）ZEA母液的配制：規格為25mg/瓶的ZEA添加785μLDMSO，溶解得到母液，-20 ℃保存備用。

5.4 大鼠原代睪丸支持細胞的分離與培養

處理Wistar大鼠，脫頸致死，全身浸泡消毒后腹部朝上固定于解剖板上。實驗過程中所用器械均已高壓滅菌完成，在無菌條件下，用眼科剪剖開大鼠腹腔，于腹股溝處提拉精索取出睪丸，將睪丸在預冷無菌的PBS溶液中清洗三遍后放入培養皿。拉散曲細精管后置于濃度為0.25%胰蛋白酶溶液（37℃）中，水浴搖床預熱37℃將曲精細管放入其中，150r/min消化15-20min后睪丸組織碎塊成粘稠線索狀，隨后加入一體積含血清的DMFM/F-12培養基，800g，4 ℃離心10 min。棄去上清液，加入0.5%膠原酶溶液（37℃），密封后放于水域搖床中，37℃，150r/min消化15-20min后溶液為粘稠狀，加入等體積含血清的DMFM/F-12培養基終止消化，用滅菌過的100目網篩過濾后800g/min 4℃離心10min。離心后無血清培養基重懸離心三遍，接種于培養皿，于37 ℃、5 % CO2條件下培養24h。實驗采取低滲法純化睪丸支持細胞，棄培養基，滅菌預熱的PBS洗滌三次將未貼壁的睪丸間質細胞清除，之后加入20μM Tris-Hcl（pH=7.4）處理3min，將不耐低滲的生精細胞脹破從而保留支持細胞。棄處理液，滅菌預熱PBS清洗三次，最后加入含血清的DMFM/F-12培養基繼續培養。

5.5 細胞染毒方法

將睪丸支持細胞在37℃、5 % CO2的條件下培養24h，用0、5、10、20μmol/L（二甲基亞砜配制）的玉米赤霉烯酮濃度染毒24h。

5.6 透射電鏡觀察細胞超微結構

將睪丸支持細胞以1.0×106cells/ml的方式，均勻接種10ml于細胞培養皿（直徑10cm）中，在37℃、5%CO2的條件下培養24h，染毒后繼續培養24h，收集所有懸浮和貼壁細胞。800g離心10min，棄上清液后貼管壁慢慢加入預冷的2.5%戊二醛1ml，在4℃靜置過夜進行固定。固定結束后，用預冷的PBS進行3次漂洗。用系列梯度的乙醇進行脫水后再用丙酮除去乙醇。以1%俄酸室溫處理2h，用環氧樹脂包埋，干燥，磨片，并采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對支持細胞進行染色，隨后于透射電鏡下觀察細胞的超微結構變化。

5.7 熒光探針法觀察ZEA對線粒體損傷的影響

接種細胞濃度以3.0×105個/ml于鋪有無菌蓋玻片的24孔細胞培養板中培養24h。不同濃度ZEA處理24h后，棄去培養基，加入37℃溫育的Mito-Tracker Green染液（線粒體綠色熒光探針），孵育15～45min；接著棄去染色液，加入培養液在熒光顯微鏡下進行觀察。

5.8 細胞凋亡的檢測

根據AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒操作方法，檢測睪丸支持細胞凋亡的情況。將原代睪丸支持細胞以每孔1.0×105個細胞的密度接種于6孔板中，添加不同濃度ZEA處理細胞24h。取上清液胰酶消化，加入1ml PBS，輕吹打細胞；1500r/min離心10min。洗滌2次后收集細胞，設置成三組進行對比，分別為空白組（未加染料）、FITC單染組、PI單染組以及雙染處理組（FITC和PI）。加入染料組之后，在室溫避光的環境下孵育30min后以1×l0Loading buffer 500μL重懸細胞，200目尼龍網過濾，每組處理三次重復。1h之內流式細胞儀檢測分析，每組檢測104個細胞。

6 結果

6.1 ZEA染毒濃度的確定

使用不同濃度ZEA（0、5、10、20、40 μM）作用于睪丸支持細胞24h，采用CCK-8法測得，各組細胞活率會隨著ZEA染毒濃度升高而降低。當ZEA濃度為40μM時細胞活率低于半數致死量。

6.2 ZEA對睪丸支持細胞線粒體損傷的觀察

不同濃度ZEA作用于睪丸支持細胞24h，通過投射電鏡觀察線粒體的變化。如圖1所示，對照組的線粒體完整，脊排列整齊規律；5μmol /LZEA線粒體出現腫脹；10μmol /LZEA線粒體腫脹現象加劇；20μmol /LZEA組線粒體出現脊脫落甚至消失，線粒體腫脹增多，空泡化增多。

圖1 不同濃度ZEA對睪丸支持細胞核的影響

6.3 ZEA對睪丸支持細胞線粒體的損傷

采用Mito-Tracker Green法檢測線粒體ZEA對線粒體的影響。結果顯示與對照組相比，染毒組（5、10、20μmol/L）熒光表達呈極顯著升高。

6.4 ZEA對睪丸支持細胞凋亡的影響

運用流式細胞術檢測睪丸支持細胞的凋亡率。如圖2顯示，染毒濃度的增加使得睪丸支持細胞的早期凋亡和晚期凋亡數量呈上升趨勢，在20μM濃度ZEA作用下凋亡率呈最高值。

圖2 ZEA對睪丸支持細胞凋亡水平

7 討論

近年來，有大量研究和實驗證實了ZEA能夠導致雄性生殖細胞和睪丸間質細胞死亡[2]，影響精子的正常發生。ZEA能夠影響雄性小鼠的精子參數，降低繁殖能力，改變內分泌腺的重量和抑制間質細胞中睪酮的合成[3]。本實驗采用不同濃度ZEA作用于睪丸支持細胞24h，通過CCK-8法測得40μM時細胞存活率低于半數致死量，證明ZEA在高濃度下明顯抑制睪丸支持細胞的生長，并呈劑量-效應關系。采用投射電鏡觀察發現，隨著ZEA暴露濃度升高，大鼠原代睪丸支持細胞出現線粒體脊腫脹、脫落甚至空泡化等超微結構的變化，說明ZEA可導致睪丸支持細胞線粒體損傷。運用流式細胞術檢測發現ZEA染毒組的細胞凋亡率呈極顯著升高，說明了ZEA可致睪丸支持細胞線粒體發生凋亡，具體的凋亡途徑及機制還有待進一步的研究。