大蒜素及茜草素抗鴿毛滴蟲藥效觀察

薛 勇，俞小紅，徐嘉萍，王 洋

（蘇州市畜牧獸醫站，江蘇 蘇州 215128）

鴿毛滴蟲病（Trichomonas gallinae）是一種單細胞原蟲病，由鴿毛滴蟲引起，主要侵害消化道上段，其主要特征是消化潰瘍、下痢等[1]。毛滴蟲病寄生于各種雞、火雞以及各野生的其他鳥類。成年鴿一般情況不出現臨床癥狀，而青年鴿死亡數中有70%以上是由于在生長過程中感染毛滴蟲引起的。幼鴿通常是因為嘗食成年鴿嗉囊里的“鴿乳”而導致感染的，幼鴿由于免疫機制沒有形成足夠的保護力，從而受到強毒蟲株的感染，導致死亡率高達50%。帶蟲幼鴿由于受到感染，不僅導致其營養吸收不良，肉質下降，而且還會成為新的感染源，感染其他幼鴿[2]。臨床上治療鴿毛滴蟲的首選藥物是具有明顯殺毛滴蟲效果的甲硝唑，但其具有較大的副作用，如致癌和人基因突變等[3]。另一方面，由于甲硝唑長期不正當的使用，毛滴蟲對其耐藥性日益顯著，治愈率逐漸下降，并有一定的復發性[4]，同時使得藥物殘留也成為突出問題。雖然中草藥沒有一些西藥見效快，但是由于中草藥都是天然和毒副作用小的藥物，因此，中草藥越來越受到人們的青睞。抗毛滴蟲中藥種類多，包括白頭翁、千里較光、大蒜素、茜草、五倍子等，對于其研究報道也較多[5]，但至今仍未見大蒜素抗鴿毛滴蟲效果觀察的報道。本試驗選用大蒜素以及茜草素進行體外殺鴿毛滴蟲的研究，結果如下。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲株及病鴿的準備

鴿毛滴蟲分離株，該蟲株分離自六合區東溝鎮養鴿場1月齡患病幼鴿，從其口腔中分離而得。3月齡感染毛滴蟲白羽王鴿病鴿200只（南京市六合區東溝鎮養鴿場提供）

1.2 試驗藥品及試劑

大蒜素（山東聚德藥業有限公司，純度＞25%），茜草素（南京澤朗醫藥公司，純度＞50%），無水乙醇（分析純AR，上海國藥集團），蛋白胨（生化試劑，中國.天津布巴斯夫化工有限公司），麥芽糖（純度＞98%），氯化鈉（分析純，西隴化工股份有限公司），L-半胱氨酸鹽（純度＞98%），青霉素（注射用青霉素鉀，恒通獸藥），鏈霉素（注射用硫酸鏈霉素，恒通獸藥）。

1.3 主要試驗儀器

FA1204B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司），BHC-13004A/B3型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設備有限公司），麥克奧迪SFC-100FL生物顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司），電熱恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 大蒜素、茜草素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察試驗

（1）樣品制備

取一定質量大蒜素、茜草素，分別配制成含有8mg/ml大蒜素原液、12mg/ml茜草素原液以及大蒜素-茜草素混合原液（包含8mg/ml大蒜素以及12mg/ml茜草素），置4℃冰箱保存備用。

（2）含藥培養基制備

將已經配置好的8mg/ml大蒜素、12mg/ml茜草素溶液及大蒜素-茜草素混合液與肝浸湯培養液按倍比稀釋，稀釋倍數分別為1：1、1：2、1：4、1：8、1：16。

（3）蟲體純化與計數

取培養24h含有鴿毛滴蟲培養液，將其在2000r/min的條件下離心10min，吸出上清液，丟棄，將1ml培養基加入沉淀中，反復吹打使其混勻，備用。用吸管吸取上述懸浮液20μl，置于380μl培養液中，稀釋20倍。取稀釋好的液體少許，滴入血球計數板計數，利用白細胞計數法進行計數（計上不計下，計左不計右，團體按單個計算），最終將鴿毛滴蟲數用培養液調整為1×105個/ml，吸取0.2ml含蟲液分別加入每個試管中，置于37℃恒溫箱內培養。分別在2h、4h、8h、12h、24h時取樣觀察，計算鴿毛滴蟲蟲體死亡率。

（4）蟲體死亡判斷標準

蟲體由梨形或者橢圓形變為圓形，邊緣從光滑變為不正，輪廓模糊，蟲體內含有數量不一的空泡，胞質內充滿大量顆粒。蟲體死亡率公式為死亡鴿毛滴蟲數/觀察總鴿毛滴蟲數×100%。

（5）數據處理

采用SPSS軟件對試驗結果進行統計學分析。

1.4.2 大蒜素、茜草素體內抗鴿毛滴蟲初步應用

（1）大蒜素-茜草素混合液準備

配制低、中、高三種不同濃度的大蒜素-茜草素混合液，備用。

（2）分組與給藥

將感染毛滴蟲病鴿隨機分成4組，每組50只，分別標記為1、2、3、4。第一組喂低濃度混合液（40mg/ml），第二組飼喂中濃度混合液（60mg/ml），第三組飼喂高濃度混合液（100mg/ml），第四組為空白對照組。連續飼喂5d。

（3）數據處理

計算5d后鴿毛滴蟲病治愈率。

2 結果與分析

2.1 大蒜素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察

蟲的平均殺蟲率是100%，可見大蒜素最低有效殺蟲濃度（MLCs）為0.5mg/ml。但隨著藥物濃度的增加，各試驗組達到100%殺蟲率所需時間大大減少。1：2濃度組（2mg/ml）殺蟲率達100%只需4h，1：1濃度組（4mg/ml）所需時間更少，為2h?？瞻自囼灲M殺蟲率比較低，與大蒜素試驗組比較有顯著性（P＜0.05）。當藥物濃度相同時，鴿毛滴蟲死亡率隨著時間的推移而逐漸增加（表1）。

表1 大蒜素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察（n=3）

2.2 茜草素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察

茜草素1：8濃度組，即0.75mg/ml在24h時對鴿毛滴蟲的平均殺蟲率是100%，得知茜草素殺滅鴿毛滴蟲的最低有效殺蟲濃度（MLCS）為0.75mg/ml。但隨著藥物濃度的增加，各試驗組達到100%殺蟲率所需時間大大減少。1：2濃度組（3mg/ml）殺蟲率達100%只需4h，1：1濃度組（6mg/ml）所需時間更少，為2h?？瞻自囼灲M殺蟲率比較低，與大茜草素試驗組比較有顯著差異性（P＜0.05）。當藥物濃度相同時，鴿毛滴蟲死亡率隨著時間的推移而逐漸增加（表2）。

表2 茜草素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察（n=3）

2.3 大蒜素-茜草素混合液體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察

大蒜素-茜草素混合液在1：8濃度組時，能在24h內達到100%殺蟲率；1：4濃度組時，4h即可將鴿毛滴蟲殺蟲率達到100%。1：1，1：2濃度組殺蟲所需時間最短，都在2h內達到100%殺蟲率。將大蒜素-茜草素混合液殺蟲率與空白試驗組比較，差異顯著（P＜0.05）（表3）。

表3 大蒜素-茜草素體外抗鴿毛滴蟲藥效觀察（n=3）

2.4 大蒜素-茜草素鴿場初步應用

大蒜素1：8濃度組，即0.5mg/ml在24h時對鴿毛滴

結果顯示，中高濃度組、中濃度組感染率降低至10%以下，效果與甲硝唑組接近，而低濃度組降低至感染率達36%，空白組感染率依舊為100%。這表明，在使用了大蒜素、茜草素組合添加劑后，大大降低了毛滴蟲的感染率，完全可以替代肉鴿養殖違禁藥物甲硝唑（表4）。

表4 大蒜素-茜草素初步應用

3 討論

本試驗結果表明，無論大蒜素還是茜草素都具有明顯的殺蟲效果。大蒜素藥物濃度在0.5mg/ml～4mg/ml時，具有明顯抗毛滴蟲作用，在上述藥物濃度范圍內，鴿毛滴蟲的死亡率隨著藥物濃度增加以及作用時間延長而升高，大蒜素24h100%最低殺蟲濃度為0.5mg/ml，4h完全殺蟲濃度為2mg/ml。茜草素藥物濃度在0.75～6mg/ml時，具有明顯抗毛滴蟲作用，在上述藥物濃度范圍內，鴿毛滴蟲的死亡率隨著藥物濃度增加以及作用時間延長而升高，茜草素24h100%最低殺蟲濃度為0.75mg/ml，4h完全殺蟲濃度為3mg/ml。

通過組合試驗表明，茜草素與大蒜素組合也能很好地抑殺鴿毛滴蟲，且具有明顯的協同作用。如大蒜素-茜草素混合液在比例為1：2時，2h殺蟲率即可達到100%，而單獨的大蒜素或者茜草素溶液在1：2時未能在2h完全殺死毛滴蟲；再如，茜草素與大蒜素組合物在1：4的稀釋度時，2h抑殺效果達到80%以上，4h后即可100%抑殺鴿毛滴蟲，效果與單獨使用1：2的大蒜素或茜草素的相似，甚至混合物稀釋度至1：8時，至24h殺蟲率仍然能達到100%。這些結果均證明了二者之間存在協同作用。但混合物的協同作用是以何種方式破壞毛滴蟲的結構并最終殺死毛滴蟲還有待于進一步研究。

在鴿場的初步應用中，大蒜素和茜草素具有明顯的抑制鴿毛滴蟲效果。高濃度與中濃度組治愈率均在90%以上，低濃度的治愈率也達64%，未用藥組感染率達96%，說明在使用了大蒜素、茜草素組合后大大降低了鴿毛滴蟲的感染率，從而可以替代違禁藥物甲硝唑，為肉鴿標準化、無害化生產提供有效的方法。

近年來，肉鴿養殖業速度發展，但由于養殖技術的不足以及飼養環境、方式的不合理，導致鴿群中毛滴蟲感染率一直處于較高位置并呈現逐年上升趨勢。因此，這就導致抗生素以及抗鴿毛滴蟲藥物使用較為頻繁。目前，在臨床運用中抗毛滴蟲藥物主要有甲硝唑、替硝唑等硝唑類藥物，雖然硝唑類藥物具有十分明顯的抗毛滴蟲效果，但鴿毛滴蟲耐藥性顯著增加，并且復發率有一定的提高，較大的副作用如致癌以及致基因突變也嚴重威脅人類健康[6]。大蒜素和茜草素作為防治鴿毛滴蟲感染的新藥，擁有綠色環保、毒副作用小等優越性，可作為硝唑類藥物的替代藥物，值得深入研究。