精子DNA碎片檢測的臨床專家共識

倪吳花，Ashok Agarwal，孫瑩璞，孫海翔，鄧成艷，劉平，周燦權，馮云，郝桂敏，盧文紅，全松，沈浣，師娟子，滕曉明，王曉紅，王秀霞，伍瓊芳，曾勇，張松英，鐘影，黃學鋒，黃國寧

(中華醫學會生殖醫學分會第五屆委員會)

背 景

常規精液指標是目前評估男性生育力的主要手段，但研究已發現其預測男性生育力的價值有限[1]。精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation，SDF)是一項新的反映精子功能的檢測指標。SDF增高常伴發少、弱精子癥，也可發生在精液常規指標正常的男性不育癥患者。SDF的發生機制復雜。很多文獻報道SDF升高與自然妊娠和輔助生殖技術結局存在負相關。因此，近年來SDF檢測已廣泛應用于男性不育的診斷和治療。為規范SDF的臨床檢測和應用，中華醫學會生殖醫學分會制定了本臨床專家共識，對SDF檢測方法、臨床意義和治療提出推薦建議。

方 法

本共識由中華醫學會生殖醫學分會發起，由男科與精子庫管理學組組織編寫，已在國際實踐指南注冊平臺(International Practice Guideline Registry Platform，IPGRP)國內版進行了注冊(注冊號為IPGRP-2020CN122)。

本共識系統檢索了PubMed、CNKI、萬方以及Cochrane library數據庫。設計與制定步驟參考了世界衛生組織(WHO)發布的《世界衛生組織指南制定手冊》、中華醫學會發布的《制訂/修訂<臨床診療指南>的基本方法和程序》和中華醫學會生殖醫學分會發布的《CSRM指南共識的制定規范(2016)》。參照GRADE方法予以證據質量評價及推薦強度評級(表1、表2)。對未能給予GRADE但有必要予以關注的問題，根據指南制定小組專家臨床經驗推薦了良好實踐要點(GPP)。

表1 GRADE證據質量評價及其定義

表2 推薦強度評級及其定義

共識內容

一、總覽

本共識包含以下11項推薦建議：

序號推薦建議證據等級推薦強度1男性高齡、精索靜脈曲張、附性腺感染以及吸煙、酗酒、肥胖、高溫等不良生活習慣可導致SDF水平升高。B22TUNEL、SCD、SCSA和堿性Comet試驗的檢測結果之間具有相關性,可用于臨床檢測SDF。B23SDF檢測可用于不明原因不育男性,有助于發現不育原因。C24SDF檢測可用于不明原因反復流產女性患者的配偶,有助于發現反復流產的病因。C25SDF檢測可用于精索靜脈曲張結扎術前和術后檢測,有助于估計手術預后。C26SDF可用于輔助生殖技術前檢測,有助于預測治療結果,包括臨床妊娠率、流產率和活產率。B27改善不良生活方式可作為SDF的基礎治療。GPP8抗氧化治療可能改善SDF。C29在對高SDF精液進行處理時,應避免精子冷凍、過高離心力、過長離心時間和長時間的37℃下體外培養。GPP10SDF增高的臨床型精索靜脈曲張不育患者可通過不同的精索靜脈結扎手術降低SDF水平。B211對高SDF患者多次采用精液精子行ICSI治療失敗者,可采用睪丸精子行ICSI治療。C2

二、SDF的定義和原因

1.定義：SDF是指精子DNA完整性受損，包括精子DNA發生堿基錯配、丟失、修飾、DNA加合和交聯、單鏈和雙鏈斷裂等，但主要指精子DNA發生單鏈和/或雙鏈斷裂[2]。

2.SDF的發生機制和原因：SDF可發生于睪丸內精子發生和成熟過程，也可發生于男性生殖道中精子運輸過程。在睪丸內精子發生過程中，精子不全凋亡(abortive apoptosis)和成熟異常是導致SDF的主要原因[2]。氧化應激導致過高的氧自由基也可激活凋亡通路誘導睪丸內精子發生異常凋亡，也可直接導致精子運輸過程中精子的脂質膜和DNA過氧化損傷而導致SDF[3-6]。文獻報道了可導致SDF增高的各種臨床因素，如男性高齡、精索靜脈曲張、附性腺感染等，以及肥胖、吸煙、酗酒和高溫等不良生活習慣可由于精子生精障礙和/或通過氧化應激導致SDF[7-13]。

序號共識建議證據等級推薦強度1男性高齡、精索靜脈曲張、附性腺感染以及吸煙、酗酒、肥胖、高溫等不良生活習慣可導致SDF水平升高。B2

三、SDF的檢測方法

1.檢測方法：文獻報道了不同的SDF檢測方法[14-18]，其中，精子染色質結構分析(SCSA)、精子染色質擴散法(SCD)、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)和彗星實驗(Comet)為目前最為常用的方法(表3)。

不同檢測方法的生物學意義可能不同，一些方法直接檢測DNA斷裂，其他方法實際上通過檢測雙鏈DNA變性為單鏈的敏感性以間接檢測DNA斷裂。目前檢測方法的不足包括：(1)檢測到的SDF 可能不具有臨床意義，如少量的單鏈DNA斷裂可被另一條完整的DNA鏈修復和復制；(2)較難以檢測特定的重要DNA位點的斷裂；(3)未能檢測精子DNA斷裂的范圍和程度；(4)沒有公認的檢測閾值。

表3 SDF的常用檢測方法

2.不同檢測方法的比較：不同SDF檢測的方法學不同，診斷特異性和敏感性有所不同，但其結果相互間仍高度相關。很多研究比較了SCSA和SCD檢測精子DNA損傷的結果，發現兩種方法間存在顯著的正相關[19-22]。比較SCSA和TUNEL方法的研究也顯示兩者之間顯著相關[23]。一項研究比較了TUNEL和SCD與SCSA的結果，發現相關系數>0.866(P<0.01)[24]。另有研究探討了TUNEL、SCD、SCSA和Comet試驗在男性不育和對照組的檢測結果，發現雖然不同方法的預測值不同，但TUNEL、SCD、SCSA和堿性Comet試驗都可以預測不育，但中性Comet試驗則不具預測作用[25]。一項Meta分析發現TUNEL、SCD和堿性Comet試驗都可以預測男性不育，但TUNEL方法的預測作用較強[26]。一項評估SDF對IVF和ICSI臨床結果影響的綜述和Meta分析發現，不同方法(TUNEL、SCD、SCSA和Comet試驗)檢測的SDF都可預測IVF和ICSI的臨床妊娠率[27]。

目前沒有足夠的研究證據支持和反對上述某種特定的SDF檢測方法[28]。

3.質量控制：與常規精液指標一樣，SDF檢測結果可能在不同時間存在個體內差異。在一項對282名進行宮腔內人工授精(IUI)或輔助生殖技術的不育男性的精液進行SDF檢測的結果表明，重復SCSA檢測SDF的平均變異系數(CV)為29%，其中大約1/3的患者在重復檢測中超過閾值水平[29]。SDF檢測結果還受到檢測程序和采用儀器的影響，因此嚴格的質量控制非常重要。

在目前沒有標準化室間質控的情況下，SDF檢測實驗室除按照WHO精液標準化程序進行精液收集和處理外，還應嚴格規定檢測精液的冷凍保存方法及時間和相關檢測設備的校準。

序號推薦建議證據等級推薦強度2TUNEL、SCD、SCSA和堿性Comet試驗的檢測結果之間具有相關性,可用于臨床檢測SDF。B2

四、SDF檢測的臨床意義

(一)SDF檢測的適應證

根據目前臨床研究證據，以下情況存在SDF的風險較大，推薦進行SDF檢測。

1.不明原因不育：很多研究表明，排除女方因素的不明原因不育男性精液SDF顯著高于正常生育男性[30-33]。在常規精液指標正常的男性不育患者中，大約5%～20%的患者SDF顯著增高[33-35]。這些研究表明，SDF與不明原因性不育相關，檢測SDF有助于發現不明原因性不育男性的可能不育原因。

2.不明原因反復流產：不明原因反復流產女性的配偶SDF顯著高于正常對照組[36-39]。一項Meta分析納入了12項前瞻性和2項回顧性研究，研究分別采用SCD、TUNEL、SCSA和Comet試驗檢測SDF，結果發現不明原因反復流產女性患者的配偶SDF比對照組高11.8%[95%CI(6.64，17.32)；P<0.001]，提示高SDF可能是不明原因流產的原因[40]。另一項Meta分析納入15項前瞻性研究(共579例反復流產女性的配偶和434例正常生育女性的配偶)，結果發現前者SDF高11.91%[95%CI(4.97，18.86)]，也表明高SDF可能是反復流產的原因[41]。歐洲人類生殖和胚胎學協會(ESHRE)的2018年反復妊娠丟失指南[42]認為SDF可能是不明原因反復流產的一個原因，級別證據中度，可用于不明原因反復流產的檢測。

3.臨床型精索靜脈曲張：大量研究表明，臨床型精索靜脈曲張患者的SDF顯著升高[12，30，43-50]。一項納入12個研究的Meta分析表明，精索靜脈曲張患者的SDF與對照相比高9.84%[95%CI(9.19，10.49)；P<0.001][46]。研究還表明，精索靜脈結扎手術顯著降低了SDF水平[46，51]，而精索靜脈結扎術后自然妊娠者的SDF顯著低于未妊娠者[52]。一項文獻復習納入21項研究共1 200多例患者，同樣發現精索靜脈結扎術在術后3～6個月顯著降低了SDF[53]。這些研究表明，臨床型精索靜脈曲張可導致SDF升高，SDF檢測有助于臨床型精索靜脈曲張結扎手術的預后判斷。

4.輔助生殖治療前檢測：近年來，關于SDF檢測對輔助生殖技術結果的預測作用有大量的研究。有關SDF對IUI結局的影響，盡管有不同的研究結論，但2項Meta分析表明高SDF降低了IUI的臨床妊娠率[54-55]。一項共納入10項研究的Meta分析研究了SDF對IUI結果的影響，結果表明高SDF者的臨床妊娠率[RR=0.34，95%CI(0.22，0.52)；P<0.001]和出生率[RR=0.14，95%CI(0.04，0.56)；P<0.001]均顯著下降[54]。另一項Meta分析也表明低SDF者的IUI臨床妊娠率顯著增高[RR=3.3，95%CI(1.16，9.39)][55]。

越來越多的研究表明SDF影響IVF和/或ICSI的臨床結局。一些研究顯示高SDF降低IVF和ICSI的臨床妊娠率和活產率，并增高流產率[56-62]；也有一些研究顯示SDF僅影響IVF[63-67]或ICSI[68-72]的臨床結局，還有一些研究的結論是SDF不影響IVF或ICSI的臨床結局[15，72-76]。近年來有多篇系統回顧和Meta分析探討了SDF對IVF/ICSI的臨床妊娠率、活產率和流產率的影響[27，77-83]。其中，4項Meta分析表明，高SDF顯著降低了IVF的臨床妊娠率[27，78-80]，一項Meta分析發現高SDF顯著降低了IVF與ICSI的臨床妊娠率[81]。一項Meta分析探究了SDF與活產率的相關性，發現高SDF顯著降低了IVF和ICSI的活產率[OR=1.17，95%CI(1.07，1.28)；P=0.000 5][82]。2項Meta分析研究了SDF對IVF/ICSI流產率的影響，發現高SDF顯著增高了IVF和ICSI的流產率[79-80]。但一項2008年發表的Meta分析發現，盡管SDF與IVF和ICSI臨床結果顯著相關[OR=1.44，95%CI(1.03，2.03)；P=0.04]，但似然比[LR(+)=1.23，LR(-)=0.81]范圍較小，顯示臨床預測價值有限[77]；一項2016年發表的Meta分析納入了30項研究，發現SDF影響IVF和ICSI的繼續妊娠率，預測敏感性為中等～好，但特異度較低，采用TUNEL和Comet試驗檢測的預測價值要高于SCSA和SCD[83]。

綜上所述，目前的證據傾向于支持SDF影響IUI、IVF和ICSI治療結局的結論。

(二)SDF檢測的診斷閾值

一些研究探討了預測輔助生殖技術臨床結局的SDF預測值，TUNEL法的閾值為4%～20%，Comet試驗的閾值為44%～56%，SCSA法的閾值為11.3%～30.3%，SCD法的閾值為17%～27.3%[67，74，82-85]。不同SDF檢測方法的閾值不同，但即使同一檢測方法也仍缺乏公認閾值。其原因可能是不同研究針對的檢測人群不同。不同中心應針對其采用的SDF檢測方法和研究人群確定診斷閾值[86]。

序號共識建議證據等級推薦強度3SDF檢測可用于不明原因不育男性,有助于發現不育原因。C24SDF檢測可用于不明原因反復流產女性患者的配偶,有助于發現反復流產的病因。C25SDF檢測可用于精索靜脈曲張結扎術前和術后檢測,有助于估計手術預后。C26SDF可用于輔助生殖技術前檢測,有助于預測治療結果,包括臨床妊娠率、流產率和活產率。B2

五、SDF的臨床處理

(一)改善不良生活方式

大量研究提示肥胖、吸煙、酗酒和高溫等不良生活方式與SDF升高相關。初步的研究表明，減重可改善精液質量和SDF并增加自然妊娠機會[87-89]。但目前尚缺乏足夠的臨床證據表明改善不良生活方式可改善SDF。盡管目前的臨床研究證據有限，但考慮到改善不良生活方式的手段簡單方便，其潛在獲益大于危害和實施成本，本共識仍推薦將其作為SDF臨床處理的基礎治療(GPP)。

(二)抗氧化治療

抗氧化劑包括維生素C、維生素E、左旋肉毒堿、輔酶Q10、N-乙酰半胱氨酸、葉酸、鋅、硒、番茄紅素和蝦青素等。不同抗氧化劑的抗氧化作用差別顯著，如體外研究表明蝦青素的抗氧化作用約為維生素E的100倍[90]。

抗氧化劑是目前治療包括SDF等各種精液異常的常用方法[90-91]。一些研究表明抗氧化劑治療顯著降低了SDF[92-97]。2019年的一項Cochrane分析納入了4個樣本量較小的隨機對照研究(RCT)，發現抗氧化劑治療與安慰劑對比，顯著降低了SDF，分析還發現不同氧化劑的作用不同[98]。目前大部分研究仍有較大設計缺陷，缺乏安慰劑對照組和雙盲設計，研究統計效率較低。抗氧化治療可能適用于精漿高氧化應激患者[99]，但尚缺乏臨床證據。進一步的研究應是采用嚴格設計的RCT，證明單獨或組合使用不同抗氧化劑改善SDF的作用以及對自然妊娠和輔助生殖技術結果的影響。

(三)精索靜脈曲張結扎手術

對臨床型精索靜脈曲張不育患者，研究表明不同的精索靜脈曲張結扎手術均可降低氧化應激水平[100]，顯著降低SDF[101-104]。一項文獻綜述系統回顧了21項前瞻性研究，發現不同的精索靜脈曲張結扎手術顯著降低了SDF，平均降低8%[53]。還有研究發現精索靜脈曲張結扎手術降低SDF并提高了自然和輔助生育的妊娠率[51]。

(四)輔助生殖技術中處理

1.縮短取精時禁欲時間：禁欲時間與精液常規指標和SDF相關，禁欲時間延長雖然提高了精液量和精子總數，但降低精液精子活率，增加了SDF[105-107]。在輔助生殖技術中，重復取精并縮短禁欲時間至1～3 h取精是一個簡單的降低手淫獲取精子SDF的方法[108-110]。縮短禁欲時間是否改善IUI臨床妊娠率的研究有不同的結論[111-112]，目前也缺乏縮短禁欲時間對IVF和ICSI治療影響的研究。最近的一項研究發現禁欲1 d的精子雖然SDF開始較低，但在體外培養6 h后SDF顯著增加20～40倍以上[105]。

縮短禁欲時間是否會改善IUI、IVF或ICSI的治療結局仍需要進一步的研究。

2.減少實驗室精液處理對SDF的影響：精子處理過程會通過增加氧自由基導致SDF升高，包括冷凍精子、過高離心力、過長離心時間和37℃下長時間培養等[113-117]。有研究發現，37℃下超過2 h培養可導致SDF顯著增加[114,118]。因此，對高SDF的精液處理應避免精子冷凍、過高的離心力、過長的離心時間和長時間的37℃下體外培養。

3.精子優選方法：上游法或密度梯度離心是實驗室精子處理的常用基本技術。處理后精子的活力和正常形態率會顯著提高。大部分文獻報道上游法和密度梯度離心可顯著降低SDF[119-122]。但有研究發現密度梯度離心并不能改善處理后的精子SDF，甚至在部分精液標本中增高了SDF水平[123]。

近年來，文獻報道了許多新的精子優選方法[124-126]。有報道精子微流體分選[127-128]、透明質酸結合試驗[129]、運動精子細胞器形態學檢查(motile sperm organelle morphology examination，MSOME)[130-132]和磁性活化細胞分選(magnetic-activated cell sorting，MACS)[132-134]都有助于篩選SDF低的精子。但采用這些優選后精子行輔助生殖技術治療是否改善臨床結果仍未獲證實。

4.采用睪丸精子行ICSI：研究發現，睪丸精子的SDF比精液精子低[135]。基于這一發現，在一些回顧性研究和小樣本的非隨機前瞻配對研究中，發現對高SDF反復精液精子ICSI失敗患者，采用睪丸精子行ICSI治療可獲得更高的臨床妊娠率[136-138]。但對于伴有嚴重少精子癥的高SDF患者，可能會有較大睪丸取精失敗的可能。采用睪丸精子ICSI需要行睪丸取精手術，可能存在麻醉和手術并發癥。睪丸精子還可能具有更高的染色體非整倍體率[139]。此外，睪丸生精細胞凋亡異常可能是高SDF的原因之一[2]，在這種情況下，睪丸精子SDF可能不會比精液精子低。因此，高SDF患者行睪丸精子ICSI的臨床價值仍需要更多研究證實。

序號共識建議證據等級推薦強度7改善不良生活方式可作為SDF的基礎治療。GPP8抗氧化治療可能改善SDF。C29在對高SDF精液進行處理時,應避免精子冷凍、過高離心力、過長離心時間和長時間的37℃下體外培養。GPP10SDF增高的臨床型精索靜脈曲張不育患者可通過不同的精索靜脈結扎手術降低SDF水平。B211對高SDF患者多次采用精液精子行ICSI治療失敗者,可采用睪丸精子行ICSI治療。C2

致謝：中華醫學會生殖醫學分會第四屆、第五屆委員會生殖男科與精子庫管理學組委員審閱了本共識。