體外受精囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)與囊胚發(fā)育潛能的相關(guān)性研究

蔡桂豐，徐楗熒，阮永銘，曾偉榮，趙琴，許偉標(biāo)，吳松

(1.珠海市婦幼保健院，珠海 519000；2.億康基因科技有限公司，蘇州 215000)

線粒體是人體細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器之一，在線粒體DNA(mtDNA)和核DNA驅(qū)動下它們負(fù)責(zé)細(xì)胞能量物質(zhì)ATP生產(chǎn)，因此也被稱為細(xì)胞的能量工廠，同時也參與介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。線粒體自身擁有一套獨(dú)立的基因組DNA，其拷貝數(shù)量取決于細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量。在成熟的人類精子中，大約有22～75個這樣的細(xì)胞器被包裹在中段周圍，而大量的線粒體分布在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[1]。受精后，主要遺傳自母系卵母細(xì)胞的線粒體會發(fā)生不對稱分離，有研究表明線粒體在發(fā)育中胚胎形成的卵裂球中分布不均衡，直到囊胚階段才自主復(fù)制[1-4]。在人類生殖過程中，生殖細(xì)胞的形成和受精、著床前胚胎的發(fā)育及胚胎著床都需要大量的細(xì)胞能量供給[5-6]，線粒體對于成功受精和正確的胚胎植入和發(fā)育至關(guān)重要，ATP含量不足與受精失敗和胚胎發(fā)育異常有關(guān)[4，7]。因此，卵母細(xì)胞中線粒體的質(zhì)量決定了卵母細(xì)胞的質(zhì)量，進(jìn)而決定了發(fā)育中胚胎的質(zhì)量[8]。

在輔助生殖技術(shù)(ART)應(yīng)用中，胚胎質(zhì)量是影響輔助生殖治療的一個關(guān)鍵因素[9]。盡管ART取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但評估胚胎生存能力的臨床工具幾乎沒有發(fā)展，胚胎學(xué)家在選擇最佳移植胚胎時仍然依賴于不精確和高度主觀的形態(tài)學(xué)和形態(tài)計(jì)量分級系統(tǒng)。重要的是，即使在植入前遺傳學(xué)檢測(PGT)篩選到染色體正常胚胎的情況下，仍然有部分移植胚胎無法植入或活產(chǎn)[10]；同時，PGT作為一種有創(chuàng)性的胚胎選擇技術(shù)對于胚胎的影響也存在爭議。2014年Stigliani等[11]發(fā)現(xiàn)，99%以上的廢棄胚胎培養(yǎng)液樣本可以檢測到mtDNA，證明培養(yǎng)液中含有mtDNA是一種常見現(xiàn)象，且與核DNA相比含量更高。近年來相關(guān)學(xué)者通過這種無創(chuàng)的方式探究了培養(yǎng)液中mtDNA與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系[11-14]，但研究數(shù)量有限，胚胎培養(yǎng)液中mtDNA與胚胎質(zhì)量的關(guān)系有待進(jìn)一步確認(rèn)。本研究選擇了第5或6天發(fā)育囊胚(D5或D6囊胚)培養(yǎng)液，應(yīng)用高通量測序(NGS)技術(shù)檢測培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)，試圖了解mtDNA拷貝數(shù)與常規(guī)胚胎形態(tài)、非整倍體性和囊胚發(fā)育時間的關(guān)系，為新的囊胚質(zhì)量評價指標(biāo)提供數(shù)據(jù)支持。

資料和方法

一、研究對象

選取2021年7—12月于珠海市婦幼保健院生殖中心就診的10名行PGT的患者為研究對象。10名患者獲得正常受精并培養(yǎng)發(fā)育至4期的36枚囊胚，采集囊胚活檢細(xì)胞和培養(yǎng)液。

10對夫婦均簽署了卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)和PGT知情同意書。醫(yī)院生殖倫理委員會對此研究項(xiàng)目通過倫理審查。

二、研究方法

1.胚胎培養(yǎng)：將成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行ICSI后轉(zhuǎn)移至G-1 PLUS培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)，16～18 h后觀察雙原核(2PN)形成情況。第3天(D3)根據(jù)胚胎質(zhì)量評分，用合適的剝卵針進(jìn)一步去除D3胚胎的顆粒細(xì)胞，每個胚胎清洗3次后轉(zhuǎn)入G-2 PLUS培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)到D4，再轉(zhuǎn)入單微滴進(jìn)行培養(yǎng)，每個培養(yǎng)滴25 μl，培養(yǎng)至D5進(jìn)行觀察并評分。

2.囊胚形態(tài)學(xué)評價：采用Garnder囊胚評分法[15]對培養(yǎng)的囊胚進(jìn)行形態(tài)學(xué)評估，參考Klimczak囊胚分類標(biāo)準(zhǔn)[16]對囊胚分組：(1)高質(zhì)量囊胚，包括3～6AA和4～6AB囊胚；(2)一般質(zhì)量囊胚，包括BB、1～3AB及1～2AA囊胚；(3)低質(zhì)量囊胚，包括AC、CA、BC、CB或CC囊胚。

3.胚胎活檢及培養(yǎng)液的收集：當(dāng)囊胚發(fā)育到4期(一般為D5/D6)，評估胚胎等級，選擇4CB/4BC以上囊胚進(jìn)行活檢。用記號筆在樣本采集管上標(biāo)號，用移液器在需采樣的培養(yǎng)液中反復(fù)吹吸3次后收集胚胎培養(yǎng)液樣本(避免吸到油滴)，收集1個培養(yǎng)滴更換1次槍頭，避免交叉污染。將樣本采集管置于迷你離心機(jī)(珠海黑馬)上，瞬時離心(4 000 r/min，5～10 s)，確保采集的樣本置于采集管底，-80℃保存。

4.單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(WGA)和NGS分析：對收集的囊胚活檢細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行WGA，然后通過ChromInst(EK100100724 NICSInstTM文庫制備試劑盒；蘇州億康基因)進(jìn)行文庫制備。使用QubitdsDNA HS Assay Kit(貨號Q32851；Invitrogen，美國)對擴(kuò)增建庫產(chǎn)物進(jìn)行純化和定量，然后使用Illumina NextSeq 550平臺(Illumina，美國)進(jìn)行雙端reads 75測序，每個樣品產(chǎn)生大約150萬個測序讀數(shù)。下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行引物接頭和低質(zhì)量序列的過濾，過濾后的高質(zhì)量reads序列比對到hg19人類參考基因組，并進(jìn)行重復(fù)reads序列去除和堿基GC含量校正，剩余唯一比對reads使用CBS分割算法進(jìn)行拷貝數(shù)變異(CNV)分析。

mtDNA含量以mtDNA拷貝數(shù)/核基因組的形式進(jìn)行量化，即平均每核基因組下mtDNA的拷貝數(shù)。把比對到線粒體基因組的測序讀取序列進(jìn)行計(jì)數(shù)，并通過比對到常染色體的讀取序列計(jì)數(shù)進(jìn)行均一化；根據(jù)以下公式計(jì)算和顯示每個核基因組的mtDNA拷貝數(shù)：mtDNA拷貝數(shù)=(比對常染色體區(qū)域數(shù)×2×比對線粒體讀取序列數(shù)量)/(比對常染色體讀取序列數(shù)×比對線粒體區(qū)域數(shù))。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、樣本分組

本次研究共收集到36枚囊胚，其中D5囊胚33枚、D6囊胚3枚。根據(jù)形態(tài)學(xué)評估結(jié)果，高質(zhì)量囊胚21枚、一般質(zhì)量囊胚12枚、低質(zhì)量囊胚3枚。根據(jù)胚胎植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測(PGT-A)結(jié)果，整倍體囊胚19枚，非整倍體囊胚17枚(表1)。

表1 囊胚評價指標(biāo)情況表

二、不同形態(tài)學(xué)質(zhì)量評價囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

根據(jù)發(fā)育囊胚形態(tài)學(xué)質(zhì)量評價分組，檢測結(jié)果顯示質(zhì)量評價為高質(zhì)量、一般質(zhì)量和低質(zhì)量胚胎組的mtDNA拷貝數(shù)分別為[(150.24±166.24)，n=21]、[(110.58±92.83)，n=12]和[(91.00±0.82)，n=3]，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 不同形態(tài)學(xué)質(zhì)量評價囊胚組培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

三、D5和D6囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

根據(jù)囊胚發(fā)育時間分組，檢測結(jié)果顯示D5和D6囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)分別為[(137.64±143.57)，n=33]和[(71.00±54.52)，n=3]，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 D5和D6囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

四、整倍體和非整倍體囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

根據(jù)囊胚活檢細(xì)胞整倍體性分組，檢測結(jié)果顯示36份囊胚活檢細(xì)胞中整倍體囊胚和非整倍體囊胚分別為19枚和17枚，其中整倍體組和非整倍體組培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)分別為[(144.79±162.17)]和[(117.88±107.14)]，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖3 整倍體和非整倍體囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

討 論

優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇是生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展所關(guān)注的一個重點(diǎn)問題。雖然現(xiàn)階段基于胚胎形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)的評估已經(jīng)在輔助生殖臨床治療應(yīng)用上取得了良好效果，但這些方法仍然存在著一定的局限性，如形態(tài)學(xué)評估的主觀判斷差異、胚胎活檢細(xì)胞遺傳學(xué)檢測的有創(chuàng)性。近年來，胚胎培養(yǎng)液或腔液中遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)引起了學(xué)者的關(guān)注，已有數(shù)據(jù)表明包括培養(yǎng)液中細(xì)胞核DNA和mtDNA可以被成功分離、檢測和分析[17-21]，這為胚胎遺傳學(xué)的無創(chuàng)評估提供了基礎(chǔ)。目前，針對核DNA的無創(chuàng)評估已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是對于囊胚培養(yǎng)液中mtDNA的無創(chuàng)評估研究較少。本研究通過NGS無創(chuàng)檢測囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)，探究mtDNA拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量的關(guān)系。

一般而言，在當(dāng)前胚胎評價中形態(tài)學(xué)質(zhì)量評分高和整倍體的囊胚具有更好的胚胎質(zhì)量或發(fā)育潛能。本研究嘗試探索不同形態(tài)學(xué)質(zhì)量評級、不同整倍體性和不同發(fā)育時間(D5/D6)的囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)的差異，研究結(jié)果與先前的一些研究有所不同。在Stigliani等[11-12]的兩項(xiàng)研究中，其中一項(xiàng)研究比較了A等級與B、C等級D2/D3胚胎培養(yǎng)液中mtDNA/核DNA比值，結(jié)果顯示兩者無明顯差異[12]；另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，可以形成囊胚的D3卵裂胚培養(yǎng)液中mtDNA/核DNA比值顯著高于不能成囊的胚胎，且可在D5發(fā)育至3或4期囊胚的D3卵裂胚培養(yǎng)液中mtDNA/核DNA比值顯著高于發(fā)育較慢的胚胎，表明高mtDNA/核DNA比值是高發(fā)育潛能胚胎的一個參考指標(biāo)[11]。李亨利等[13]對卵裂期胚胎培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)在不同胚胎形態(tài)學(xué)質(zhì)量分組中進(jìn)行了比較，研究結(jié)果提示，形態(tài)學(xué)優(yōu)質(zhì)組(以卵裂球數(shù)目判定)顯著高于非優(yōu)質(zhì)組，發(fā)育正常速度組顯著高于異常速度組，而高評分組與低評分組無顯著差異。本研究中，在高質(zhì)量、一般質(zhì)量、低質(zhì)量囊胚以及D5、D6囊胚分組中并未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)的顯著差異。分析其原因可能因?yàn)椋煌瑫r期胚胎樣本、胚胎形態(tài)學(xué)評價的標(biāo)準(zhǔn)、mtDNA檢測方法和量化方法造成了研究間結(jié)果的不一致。

Zhang等[14]進(jìn)一步對囊胚培養(yǎng)液中mtDNA進(jìn)行了研究，多重因素線性回歸分析顯示，培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)與囊胚活檢細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)(P=0.001)、女性年齡(P=0.012)、囊胚評分(P=0.014)呈顯著正相關(guān)，但與囊胚染色體整倍體性無明顯相關(guān)性(P=0.138)，說明囊胚活檢細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)、女性年齡、囊胚評分可能是影響培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)的因素。本研究未進(jìn)行線性相關(guān)性分析，但從不同分組間平均mtDNA拷貝數(shù)的數(shù)據(jù)可以看到，從低質(zhì)量到高質(zhì)量囊胚呈現(xiàn)上升趨勢，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能因?yàn)楸狙芯恐信咛バ螒B(tài)學(xué)評價的標(biāo)準(zhǔn)和mtDNA拷貝檢測方法不同于上述研究。同時也有研究提出，目前囊胚培養(yǎng)液中DNA來源不明、DNA產(chǎn)量和完整性較低、潛在外源性污染、培養(yǎng)液或囊腔液樣本采集標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、數(shù)據(jù)處理和分析不一致等問題對培養(yǎng)液中遺傳信息的無創(chuàng)研究帶來了挑戰(zhàn)[21-22]，這也可能是影響目前研究結(jié)果差異的重要原因。

但本研究仍存在一些不足之處：首先，研究納入的胚胎樣本數(shù)量較少，導(dǎo)致最后分組間差異較大；其次，未納入胚胎移植及妊娠結(jié)局的相關(guān)數(shù)據(jù)，導(dǎo)致研究結(jié)論有一定的局限性。后續(xù)應(yīng)完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，開展更大樣本量的隊(duì)列研究加以分析。

綜上所述，不同形態(tài)學(xué)評級、囊胚發(fā)育時間和染色體整倍體性囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)無顯著差異，胚胎質(zhì)量與培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)的關(guān)系有待進(jìn)一步確認(rèn)。在當(dāng)前囊胚培養(yǎng)液mtDNA拷貝研究數(shù)據(jù)較少的情況下，本研究為進(jìn)一步探究囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量關(guān)系提供了參考數(shù)據(jù)。