牡丹高溫脅迫研究進展

林邦語 李之俊 高 燕 李天耀 夏軒澤

（1浙江農(nóng)林大學暨陽學院，浙江諸暨 311800；2諸暨市農(nóng)業(yè)技術推廣中心，浙江諸暨 311800）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）為芍藥科芍藥屬落葉灌木，是中國的傳統(tǒng)名花，為中國十大名花之一，有“花中之王”的美譽[1]。牡丹性喜溫暖、干燥且涼爽的氣候。近年來，我國南方夏季常出現(xiàn)40 ℃左右的連續(xù)高溫天氣，導致江南牡丹品種群逐漸縮小，因而篩選適應高溫脅迫的牡丹品種迫在眉睫。高溫及相關交叉脅迫是造成牡丹生長不良甚至死亡的重要原因。通過研究牡丹高溫熱害的發(fā)生規(guī)律，揭示牡丹避熱、抗熱的生理機制，尋找高效的抗熱避熱技術措施，對于改善牡丹栽培環(huán)境、保障牡丹健壯生長、實現(xiàn)選種引種等具有重要意義。

植物的抗逆性有避逆性、耐逆性2種表現(xiàn)，多數(shù)植物能夠通過耐逆性來適應逆境脅迫，并且可分為外部形態(tài)結構上的適應和內部生理代謝上的調節(jié)[2]，主要通過活性氧清除、逆境蛋白合成、滲透調節(jié)物質及激素含量的提高等方式，來適應多種脅迫環(huán)境[3]。外源添加物可以通過催化植物體內的活性酶類物質聯(lián)合作用，起到調節(jié)植物的生理活動的作用，從而提高植物抗性[4]。因此，外源添加物質已被廣泛應用于經(jīng)濟作物、觀賞植物抗逆性研究的多個方面[5]。

當前，已有諸多關于高溫脅迫對牡丹影響的研究，但仍缺乏系統(tǒng)性的對比、整理、分析。為此，本文從牡丹的生理生化特性方面概述了高溫脅迫對牡丹的傷害及其發(fā)生機制，簡述了近幾年來植物外源添加物質在牡丹抗熱性中取得的研究成果，介紹了當前牡丹耐熱品種篩選與評價的研究進展，為牡丹引種和育種栽培提供理論參考。

1 高溫脅迫對牡丹植株形態(tài)的影響

WANG 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高溫對牡丹光合作用的影響主要體現(xiàn)在高溫會引起葉片收縮程度增加、氣孔長度和寬度減小以及氣孔關閉等。高溫時牡丹葉片表現(xiàn)出明顯熱害癥狀，葉緣褐化明顯，葉片卷曲皺縮，葉面積狹窄，植株趨于枯萎[7]。LI 等[8]通過對比高溫下3個牡丹品種的葉片形態(tài)，發(fā)現(xiàn)3個牡丹品種的葉片厚度隨高溫脅迫時間的延長而增加，以‘胡紅’增加最多且最耐熱。說明不同牡丹品種的葉片厚度可作為衡量牡丹耐熱性的指標之一，即葉片厚度越厚，水分蒸騰越慢，失水越少，以此來減弱高溫對牡丹的傷害。

2 高溫脅迫對牡丹生理生化特性的影響

2.1 對生物膜透性的影響

植物的耐熱性能夠用高溫下細胞膜的穩(wěn)定性來反映[9]，在高溫下細胞膜的流動性、通透性得到提升，蛋白質功能發(fā)生變性[10]。丙二醛（MDA）含量是常用的膜脂過氧化指標，細胞中MDA含量的升高表明細胞膜的完整性受到傷害。騫光耀等[11]通過探究3個牡丹品種在高溫脅迫下的生理響應發(fā)現(xiàn)，‘鳳丹白’‘洛陽紅’‘映金紅’葉片中MDA含量和細胞膜相對透性呈上升的趨勢，與駱俊等[12]、姚奕平[13]的研究成果一致。張旻桓[14]研究發(fā)現(xiàn)，‘香丹’MDA含量隨脅迫的加深表現(xiàn)出先升后降的趨勢[14]。在短期且適度的高溫環(huán)境下，該條件不會對牡丹生長造成不良影響[15]。持續(xù)的高溫導致牡丹葉片脂膜過氧化程度和膜的透性增加，使得細胞喪失其細胞膜系統(tǒng)的半透性，引起代謝系統(tǒng)和信號傳遞系統(tǒng)發(fā)生紊亂，電解質滲透率增加，且隨著高溫脅迫強度的上升而繼續(xù)增加[6，12]。另外，高溫還會致使葉綠體、線粒體等細胞器產(chǎn)生活性氧（ROS），從而引起氧化應激反應，形成大量ROS，不斷積累內源、外源活性氧[16]。任增斌等[17]通過外施油菜素內脂來提高牡丹在高溫下的抵抗能力，有效緩解高溫對牡丹光合作用的抑制，提高葉片凈光合速率，增強光合能力，有效降低高溫對抗氧化系統(tǒng)和細胞膜結構的傷害，提高牡丹耐熱性，其中以1.0 mg/L濃度的油菜素內脂處理效果最好。李思龍等[18]、郭紹霞等[19]通過接種AM真菌來減弱高溫對細胞膜的傷害，緩解葉綠素的分解，調節(jié)牡丹的吸水和保水能力，降低植株蒸騰作用，防止水分過度蒸發(fā)，其效果隨著時間的延長越顯著，從而提高了牡丹的抗熱性。

2.2 對光合作用的影響

植物體生長發(fā)育、生態(tài)適應情況在很大程度上受光合作用的影響，葉片光合參數(shù)能夠反映出植物光合效率狀況[20]。高溫是阻礙植物生長發(fā)育的脅迫因子之一[21]，植物在逆境脅迫下最為敏感的器官是葉片[22]，最敏感的生理過程則主要體現(xiàn)在光合作用方面，并且植物對環(huán)境脅迫響應的共同特征是葉片凈光合速率的降低[23]。高溫脅迫降低了牡丹體內葉綠素含量，葉綠素類囊體膜漏失，葉綠體結構被破壞，活力下降，使植物葉綠素的合成發(fā)生障礙[10]，并且引起牡丹葉片體內凈光合速率Pn、蒸騰速率Tr、氣孔導度Gs、呼吸速率RR降低，胞間二氧化碳濃度Ci升高[24]。前人研究發(fā)現(xiàn)，引起植物Pn下降的主要原因分為氣孔限制性因素和非氣孔限制性因素，引起植物光合速率降低的自身因素包括氣孔的部分關閉和葉肉細胞光合活性下降，前者使Ci降低，而后者使Ci增高[25]，牡丹在高溫脅迫中Pn的下降主要是受非氣孔限制性因素決定[26]。高溫脅迫顯著限制牡丹光合曲線參數(shù)Pnmax，大多數(shù)牡丹品種的表觀量子效率（AQE）在脅迫初期顯著下降，在高溫脅迫初期，牡丹葉片光飽和點（LSP）顯著降低并伴隨著光補償點（LCP）顯著升高，表明牡丹通過縮小光適應范圍以緩解高溫脅迫造成的損害[8]。葉綠素是光合的探針，光系統(tǒng)對光能吸收、傳遞、耗能等狀況能夠通過葉綠素熒光基本參數(shù)的變化表現(xiàn)出來[27]。植物PS Ⅱ反應中心經(jīng)高溫脅迫后會暫時失活，其吸收的光能以熱耗散和葉綠素熒光耗散的比例將增加，從而降低吸收光能的轉換效率，而此時的PS Ⅱ反應中心只吸收光能卻不傳遞、轉化光能，以此來緩解高溫脅迫對反應中心帶來的傷害，這是許多植物本能的防御機制[28]，并且在高溫干旱脅迫下抗性越弱的牡丹品種PS Ⅱ反應中心葉綠素熒光能量分配調節(jié)機制比不上抗性強的品種[29]。Ji 等[26]、劉春英等[30]研究發(fā)現(xiàn)，高溫均引起牡丹葉片F(xiàn)v/Fm、φEo、ΨO、PIabs等葉綠素熒光參數(shù)的變化，導致牡丹葉片光合速率和光化學特性下降，PS Ⅱ反應中心部分失活，PS Ⅱ反應中心供體側和受體側以及放氧復合體失活，抑制了光合碳代謝的電子供應和光合作用的進行[26，30]。高溫強光脅迫對牡丹的傷害亦是如此，但高溫脅迫與強光脅迫對牡丹PS Ⅱ反應中心影響不同，高溫脅迫主要體現(xiàn)在抑制PS Ⅱ供體側和受體側方面，而強光脅迫對PS Ⅱ反應中心有著顯著影響，PS Ⅱ受體側與供體側抑制則略顯輕微，高溫強光交叉脅迫較單一脅迫而言，對光系統(tǒng)光抑制的程度加重[20]。盛瑞艷等[31]在光溫交叉脅迫研究的過程中發(fā)現(xiàn)，伴隨著PS Ⅱ的最大光化學效率的下降，在PS Ⅱ供體側和受體側損傷方面，交叉脅迫較單一高溫脅迫輕。陳大印等[32]研究表明，光抑制主要是由光的增強所引起的，溫度的變化起促進作用，并且高溫強光脅迫引起葉片光化學效率降低，植物產(chǎn)生的激發(fā)能顯著減少，PS Ⅰ和PS Ⅱ激發(fā)能分配嚴重失衡，過多激發(fā)能被分配到PS II，造成PS Ⅱ激發(fā)壓升高，使PS Ⅱ的傷害程度加重[32]。

2.3 高溫脅迫對相關酶活性的影響

在反映高溫脅迫對牡丹生理生化影響的研究中，主要采用游離脯氨酸Pro、葉綠素Chl、丙二醛MDA、可溶性蛋白SP、超氧化物歧化酶SOD 等生理生化指標，其次是采用過氧化氫酶CAT 活性、H2O2含量、可溶性糖SS 含量、過氧化物酶POD 活性等生理生化參數(shù)[14]。徐艷[33]通過鄧肯氏新復級差檢驗法分析，發(fā)現(xiàn)在濕熱脅迫下牡丹葉片的電導率、MDA、脯氨酸、蛋白質、相對含水量、SOD 和CAT 活性的變化等指標具有較強的規(guī)律性，可作為牡丹抗?jié)駸崮芰娙醯蔫b別指標[33]。植物在高溫脅迫下，Pro合成酶自身含量反饋受到抑制，Pro 積累量大，滲透調節(jié)能力增強，達到去除ROS、減輕膜氧化損傷的功能[34]。駱俊等[12]分別用40、35 和30 ℃處理牡丹，發(fā)現(xiàn)高溫引起牡丹Pro含量升高，且牡丹體內Pro含量隨溫度升高而上升，脅迫結果與騫光耀、徐艷等一致[11，13，14，35]。高溫引起牡丹體內SS 下降，這可能由于溫度升高，加快了淀粉向可溶性糖分解的速度，與此同時呼吸作用增強，消耗掉儲存在細胞中的糖，二者同時發(fā)揮作用，導致了不同種類中可溶性糖含量變化存在差異[11]。SOD 是植物氧代謝的關鍵酶，能夠防止超氧陰離子自由基損傷細胞，減輕膜脂質過氧化[11]；POD 可以去除H2O2和其他氧化物，并降低氧化能力，促進更強的羥自由基生成，減少膜系統(tǒng)損傷，是植物抗氧化脅迫的常用指標之一[35]。徐艷等[35]比較分析了高溫下5 種牡丹品種的生理變化，結果表明，不同牡丹品種葉片H2O2含量、MDA含量、SS含量、CAT活性、Pro含量、POD活性總體均呈上升趨勢，SP含量、葉綠素含量呈下降趨勢，SOD活性降低或先升高后降低，趨勢與其他學者一致[11，14]。連續(xù)的高溫使得牡丹植株的損傷程度不斷加重[35]，牡丹葉片通過增大電導率、積累游離脯氨酸含量、提高體內過氧化物酶活性來維持牡丹正常生長并形成一定的抗熱性[12]。張旻桓[14]、吳莎[36-37]、肖瑞雪[38]等通過噴施ABA、SA 和CaCl2等物質來緩解高溫對牡丹的危害，分別以40 mg/L、100.0 μmoL/L 和40.0 mmoL/L為最佳施用濃度，結果表明，施用ABA、SA、CaCl2能夠增加牡丹幼苗葉片中葉綠素的含量，減少細胞質膜透性，降低膜脂的過氧化作用，增強抗氧化酶的活性，增加滲透調節(jié)物質的含量，從而增強牡丹幼苗的耐熱性，減輕高溫傷害，提高幼苗干物質累積量，適當施用有利于生產(chǎn)上品質和產(chǎn)量的提高。

3 高溫脅迫下牡丹耐熱機理研究

為深入研究高溫脅迫下觀賞植物品質的變化，采用現(xiàn)代分子生物學和轉錄組學方法發(fā)掘關鍵基因，解析關鍵基因調節(jié)耐熱分子機制，是選育耐熱優(yōu)良品種的重要途徑[39]。熱激蛋白是高溫脅迫誘導的一類主要功能蛋白，包括HSP60、HSP70、HSP90、HSP100 和小分子量熱激蛋白5 大類[40]。郝力慧[16]‘羽紅’為試材，用轉錄組測序的結果證明，PsHSP基因能在短時間內對高溫脅迫做出快速應答，參與牡丹耐熱調控，HSPs可能直接參與到高溫脅迫下牡丹的分子調控過程。MA 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，PsHSP17.8、PsHSP21和PsHSP27.43個sHSPs的功能與牡丹的熱脅迫有關，能夠通過提高SOD 活性和脯氨酸含量來提高牡丹耐熱性。朱紹華[7]以‘羽紅’為研究對象，發(fā)現(xiàn)差異蛋白在含有丙酮酸代謝和碳代謝的代謝通路上富集程度最高，而在內質網(wǎng)蛋白質合成及光合作用通路上次之，還發(fā)現(xiàn)肽基脯氨酰基異構酶、APX、HSPs、FBA、CaM、RubisCo、乙酰輔酶A 羧化酶和GS 可能是江南牡丹在高溫脅迫響應過程中起重要作用的目的蛋白。姚奕平[13]通過開展權重共表達網(wǎng)絡分析WGCNA 發(fā)現(xiàn)，在高溫下，PoPSAO、PoLH?CA3可能與牡丹光合作用機制的調控過程有關；PoWRY53可能參與到牡丹抗氧化酶活性的負調控機制中；PoHsfB2b可能在調控牡丹高溫脅迫能力的過程中發(fā)揮重要作用。此外，王曉曉[42]基于RNASeq 技術建立了高溫脅迫下‘鳳丹’的響應轉錄組數(shù)據(jù)庫，篩選出237 個與HSP、光合作用、氧化應激以及ABA信號轉導相關的候選基因，發(fā)現(xiàn)MWCNTs激活ASA-GSH 循環(huán)，減輕高溫對‘鳳丹’所帶來的傷害，抗氧化能力增強顯著減少ROS累積，從而保持了細胞膜穩(wěn)定和葉肉細胞完整，并且增強了光合作用，最終匯集成‘鳳丹’高溫耐受性的提高。

4 不同品種耐熱性評價

有研究者已通過不同的分析手段對牡丹耐熱性進行分析比較，例如，騫光耀等[11]通過SP、SS、Pro、MDA 含量以及SOD 活性比較分析了洛陽紅、鳳丹白、映金紅3個品種的耐熱性，得出鳳丹白是三者中耐熱性最好的品種。徐艷等[35]在對不同品種的牡丹進行耐熱性綜合評價中采取隸屬函數(shù)值法，隸屬函數(shù)值法不僅可以消除個別指標所造成的片面性，而且D 值是無量綱的純數(shù)，這提高了品種之間耐熱性差異之間的可比性，并且得出，牡丹的耐熱能力能夠被游離脯氨酸含量、電導率、丙二醛含量、過氧化氫酶活性更好地體現(xiàn)。張旻桓[14]用AHP 法建立了湖南牡丹品種生態(tài)適應性綜合評價體系，提出熱害指數(shù)HII、相對含水量REC、Chl 含量、SS 含量4 個指標能夠作為評價外源物質誘導牡丹耐熱性的指標，能夠顯著反映牡丹品種耐熱性。通過檢測38 種牡丹品種在高溫脅迫下葉片的各項生理指標，李苗等[43]運用主成分和隸屬函數(shù)分析構建牡丹耐熱性的綜合鑒定和評價體系，篩選耐熱性強的牡丹品種資源。依據(jù)前人研究結果，耐熱性越強的牡丹品種，在葉綠素降解、MDA 含量降低、SOD 活性保持上更具優(yōu)勢[11]。劉俊娟[29]通過牡丹高溫干旱脅迫試驗發(fā)現(xiàn)，牡丹葉片PSⅡ系統(tǒng)在脅迫下受到光化學傷害，并且系統(tǒng)通過提高熱耗散來提高其自身保護機制，電子傳遞能力下降，同時，抗性越弱的品種的PSⅡ反應中心葉綠素熒光能量分配調節(jié)機制比不上抗性強的品種。牡丹品種‘豆綠’‘冠世墨玉’‘迎日紅’‘金閣’‘首案紅’‘肉芙蓉’‘藏嬌’和‘鳳丹白’為較耐熱品種[11，35]。

5 展望

當前，關于牡丹耐熱性的研究已取得了較大進展。牡丹在高溫脅迫方面的研究主要集中在生理生化特性和外源物質對其耐熱性的影響方面，并且已有部分研究開始探索高溫脅迫下牡丹相關蛋白和耐熱基因的調控機制，為篩選和培育耐熱牡丹品種，實現(xiàn)牡丹種質資源創(chuàng)新提供理論支撐。關于高溫對牡丹生理生化的危害正逐步清晰，外源物質對提高牡丹抗熱性的機理亦趨于明了，但對牡丹的耐熱機制研究仍不夠深入，目前僅探明部分調控機制，對于其他可能參與牡丹熱激反應的影響因子仍有待進一步考究。

環(huán)境是各因素綜合作用的結果，在研究高溫脅迫的同時，還應考慮到其他環(huán)境因子對脅迫的影響以及交叉脅迫對牡丹生長的影響，交叉脅迫不是單一脅迫的簡單疊加，對牡丹的影響傷害更為嚴重。當前，牡丹交叉脅迫研究僅在高溫強光脅迫對牡丹的光合作用的影響方面較為系統(tǒng)，仍需從其他角度深入研究交叉逆境脅迫對牡丹生長的影響，從牡丹自身生物學特性出發(fā)，為未來牡丹種質資源在引種馴化與栽培利用方面提供進一步的理論依據(jù)。

如今，運用RNA-Seq 技術已能構建部分牡丹響應高溫脅迫的轉錄組數(shù)據(jù)庫，同時牡丹的多組學研究已成為新興方向，對各組學的數(shù)據(jù)進行充分整合分析，從多角度進行全方位、深入的理解，能夠全面地了解牡丹的生物系統(tǒng)。當前，對于提升牡丹耐高溫性的栽培措施研究仍較少，大量相關文獻聚焦在牡丹生理機制層面，鮮有研究將理論成果轉化為實際的栽培措施，如林下栽培對牡丹熱害緩解方面。因此，今后還應收集、豐富牡丹優(yōu)良種質資源，開展具有優(yōu)良性狀、特色觀賞價值的牡丹品系育種工作，促進牡丹新優(yōu)品種的引種和擴大栽培，最終實現(xiàn)牡丹花卉業(yè)的蓬勃發(fā)展。