貓棒束孢對IR-Hep G2細胞氧化應激的改善作用及機制*

陳靜靜 陳麗霞 趙莉莉 楊永明 楊喜花,

(1.山西醫科大學公共衛生學院，山西 太原 030001；2.山西醫科大學附屬腫瘤醫院實驗動物中心，山西 太原 030013)

糖尿病是由胰島素分泌受損和對胰島素敏感的靶器官反應能力下降所引起的一種以高血糖為特征的代謝性疾病，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)占所有糖尿病的患者的95%以上[1]，胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是其發病機制之一，當機體出現IR時，胰島素作用的靶器官(主要是肝臟、脂肪、骨骼肌)對葡萄糖的利用率下降[2]，引起血糖升高，而細胞間與細胞內的血糖濃度升高將導致氧化應激，氧化應激改變分子和細胞成分，影響細胞機制，進一步加重IR[3]。

冬蟲夏草是我國傳統名貴中藥，與人參、鹿茸并列為三大補品，有著極高的藥用價值，其活性組分及中成藥制品(如百令膠囊、金水寶膠囊)在防治糖尿病及其并發癥上發揮著重要作用[4-5]。貓棒束孢(Isaria felina，IF)是從天然冬蟲夏草蟲草體中分離得到的一株真菌，由中國科學院微生物研究所郭英蘭教授鑒定為貓棒束孢Isaria felina(DC.：Fr.)Fr，被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏 (保藏號：CGMCC NO.0706)。前期我們已完成對貓棒束孢成分的分析測定，其藥效成分主要有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇等[6]，具有免疫調節[7]、抗腫瘤[8]、腎臟保護[9]等藥理作用。前期動物實驗已證實IF能夠降低T2DM血糖，改善氧化應激狀態，本試驗探討IF對胰島素抵抗Hep G2細胞模型的改善作用及可能機制，為其治療2型糖尿病提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肝癌Hep G2細胞由山西醫科大學公共衛生學院王東新教授惠贈，由山西醫科大學附屬腫瘤醫院傳代保種。IF由山西醫科大學附屬腫瘤醫院自制。胰島素注射液(江蘇萬邦生物醫藥有限公司，批號：H10890001)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號20070501)、DMEM培養基(Biological Industries，批號：2045184)、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為：20211126、522P054)。葡萄糖(GLU)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物科技公司，批號分別為：20210629、20220312、20220310)；IRS-1、PI3K、Akt試劑盒(凡科維商城，批號分別為：202205、202202、202202)。

1.2 儀器與設備 311型CO2培養箱(美國Thermo公司)；Sun Rise酶標儀(奧地利Tecan公司)；Leica 090-135.001倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Olympus CX21FS1型光學顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)；HR-40 II A2型生物安全柜(青島海爾醫用低溫科技有限公司)；KDC-2044型低速冷凍離心機(科大創新股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 Hep G2細胞的復蘇與傳代培養 利用含10%胎牛血清、1%青、鏈霉素的DMEM高糖培養基，37 ℃、5% CO2飽和濕度下對細胞進行培養，0.25%胰蛋白酶進行消化、傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 MTT法確定細胞給藥安全范圍 將高糖DMEM培養的Hep G2細胞按1×105個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h后棄去原培養基，設立正常組和干預組，干預組加入含有貓棒束孢(終濃度為5、10、20、40、80、160、320、640 μg·mL-1)的細胞培養基200 μL繼續培養24 h，用MTT法檢測細胞存活率。

1.3.3 MTT法確定胰島素誘導安全范圍 將高糖DMEM培養的Hep G2細胞按1×105個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h后棄去原培養基，設立正常組和干預組，干預組加入含有胰島素(終濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1)的細胞培養基200 μL繼續培養24 h和48 h，用MTT法檢測細胞存活率。

1.3.4 細胞分組及上清中葡萄糖含量測定 將高糖DMEM培養的Hep G2細胞按1×105個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h后棄去原培養基，除正常組外其余孔加入含胰島素10-8mol·L的高糖DMEM培養基200 μL，誘導48 h后，吸棄原培養基，分別設立正常組(NC)、模型組(MC)、IF低劑量(IF-L)組、IF高劑量(IF-H)組，正常組和模型組加入200 μL DMEM培養基，各給藥組加入含貓棒束孢水提取液(5、10 μg·mL-1)的DMEM培養基200 μL，于37℃、5% CO2的培養箱內孵育24 h后，用葡萄糖試劑盒檢測上清液中的葡萄糖含量，以正常孔葡萄糖含量減去各孔葡萄糖含量計算出每孔細胞的葡萄糖消耗量。

1.3.5 氧化應激水平測定 根據MDA、SOD試劑盒說明書測定各分組IR-Hep G2細胞中MDA、SOD的水平。

1.3.6 ELISA檢測IRS-1/PI3K/Akt通路相關蛋白含量 根據IRS-1、PI3K、Akt試劑盒說明書測定各分組IR-Hep G2細胞中IRS-1、PI3K、Akt的含量。

2 結果

2.1 藥物對細胞存活率的影響 各劑量組的貓棒束孢處理后的Hep G2細胞存活率均高于對照組(P<0.05)。IF濃度在5 μg·mL-1和10 μg·mL-1對細胞生長無顯著促進作用，因此濃度選用5 μg·mL-1和10 μg·mL-1。見表1。

表1 不同濃度貓棒束孢處理后對Hep G2細胞存活率的影響Table 1 Effects of different concentrations of IF on survival rate in Hep G2 cells

2.2 胰島素對細胞存活率的影響 除10-5mol·L-1組外，其余劑量組經胰島素處理后的Hep G2細胞24 h細胞存活率均無統計學意義(P>0.05)。在處理48 h后，只有10-8mol·L-1劑量組對細胞生長無顯著抑制作用，綜合選用10-8mol·L-1的胰島素誘導48 h建立IR-Hep G2模型。見表2。

表2 不同濃度胰島素處理后對Hep G2細胞存活率的影響Table 2 Effects of different concentrations of insulin on survival rate in Hep G2 cells

2.3 貓棒束孢對IR-Hep G2細胞模型的影響 與正常組比較，模型組IR-Hep G2細胞的葡萄糖消耗量顯著下降(P<0.01)，說明IR-Hep G2模型建造成功。與模型組比較，各濃度貓棒束孢干預后的IR-Hep G2細胞的葡萄糖消耗量顯著上升(P<0.01)，說明貓棒束孢能夠恢復IR-Hep G2細胞對葡萄糖的攝取能力。見圖1。

圖1 貓棒束孢對IR-Hep G2細胞葡萄糖消耗量的影響Figure 1 Effects of IF on glucose consumption in IR-Hep G2 cells注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

2.4 氧化應激水平測定 與正常組相比，模型組IR-Hep G2細胞的SOD含量顯著下降(P<0.01)，MDA含量顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，貓棒束孢(5 μg·mL-1)干預后的IR-Hep G2細胞的SOD含量顯著上升(P<0.01)，MDA含量顯著下降(P<0.01)，貓棒束孢(10 μg·mL-1)干預后只顯著升高MDA含量(P<0.01)。見圖2。

圖2 貓棒束孢對IR-Hep G2細胞氧化應激水平的影響Figure 2 Effects of IF on oxidative stress of IR-Hep G2 cells注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

2.5 對IRS-1/PI3K/Akt信號通路的影響 與正常組相比，模型組IR-Hep G2細胞的IRS-1、PI3K、Akt的含量顯著降低(分別為P<0.01、P<0.01、P<0.05)，與模型組相比，貓棒束孢(5 μg·mL-1)干預后，IRS-1、PI3K、Akt的含量顯著上升(分別P<0.01、P<0.01、P<0.01)，貓棒束孢(10 μg·mL-1)干預后，只有PI3K的含量顯著上升(P<0.05)，見表3。

表3 貓棒束孢對Hep G2細胞IRS-1、PI3K、Akt含量的影響Table 3 Effects of IF on contents of IRS-1、PI3K、Akt in Hep G2 cells

3 討論

肝臟是人體最大的糖代謝器官，通過糖酵解、肝糖原的合成與分解、糖異生等途徑參與機體對葡萄糖的代謝，是胰島素作用的靶器官之一。Hep G2細胞是一種與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株，具有肝細胞的許多生物學特性，由Hep G2細胞建立的IR模型是公認的用于研究IR發生機制的理想模型[10]，常用于研究降糖藥物的作用機制。IR是機體對生理濃度的胰島素的敏感反應性低于正常生物學效應的一種病理狀態,主要表現為胰島素抑制肝臟葡萄糖釋放以及外周組織 (脂肪和肌肉) 利用葡萄糖能力下降[11]。本實驗通過將Hep G2細胞置于1×10-8mol·L-1的胰島素中48 h建立IR模型，并給予IF干預，結果顯示，IF能夠提高IR-Hep G2的葡萄糖消耗量，改善糖代謝。

氧化應激是機體內氧自由基產生過多，抗氧化防御功能損害，導致機體氧化和抗氧化狀態失衡，會導致蛋白質、核酸等大分子物質的氧化損傷[12-13]，自由基與脂質結合后，誘導脂質過氧化產生MDA，因此MDA的定量被廣泛用作氧化生物標志物，以評估組織中氧自由基含量及細胞損傷程度[14]。SOD是酶抗氧化防御系統中的重要組成成員，是對抗氧化應激的第一道生理防線，對機體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用，能夠清除超氧陰離子自由基O2-并保護細胞免受損傷[15-17]。高血糖是引起氧化應激和氧化物產生的最重要的原因之一，氧化應激在胰島素抵抗中發揮著關鍵作用，氧化應激程度增加被認為有助于糖尿病及其并發癥的發生發展[14]。已有研究[18]證實，抗氧化治療可以逆轉肥胖小鼠模型中脂肪組織的胰島素抵抗，抗氧化劑補充劑不僅可以降低細胞氧化應激水平，改變膜性質來改善胰島素作用并降低葡萄糖水平[19]，也對糖尿病繼發性并發癥有效。IRS-1/PI3K/AKT信號通路是胰島素調節葡萄糖代謝最主要的信號通路，正常狀態下通過級聯反應發揮著調節血糖穩態的作用，SOD分泌不足，MDA產生過多，機體處于氧化應激狀態時會抑制胰島素與IRS-1的結合，進一步抑制胰島素受體(InsR)和PI3K的磷酸化，導致胰島素信號傳導異常，細胞對葡萄糖的攝取和利用能力受損，胰島素敏感性降低，繼而又加重胰島素抵抗程度[20]，血糖持續升高促進T2DM的發生。本研究中，IF可以通過緩解IR-Hep G2細胞的氧化應激水平，恢復胰島素與IRS的結合，通過PI3K/AKT信號途徑調節葡萄糖的轉運及代謝，發揮胰島素生理學效應。

4 結論

IF能夠提高IR-Hep G2細胞模型中葡萄糖的消耗量，提高SOD含量，降低MDA含量，改善細胞氧化應激水平，并通過調控IRS/PI3K/AKT信號通路改善胰島素抵抗。該試驗從細胞層面敘述了貓棒束孢對胰島素抵抗改善的上游信號作用機制，后續將繼續探討貓棒束孢對PI3K/AKT信號通路下游靶向糖原合成激酶3和葡萄糖轉運體4的調控機制。