加味黃芪桂枝五物湯抑制線粒體凋亡預防奧沙利鉑周圍神經毒性機制*

吳艾平 吳林龍 張紅穎 魏國利 馬駿

(1.淮安市中醫院，江蘇 淮安 223001；2.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028)

奧沙利鉑為臨床最常用的化療藥物之一，尤其對消化系統腫瘤常作為基石使用，但奧沙利鉑導致的周圍神經毒性(Oxa-inducedperipheralneuropathy，OIPN)是其最常見的毒副作用之一，發生率可高達90%，然而目前國內外相關指南未推薦任何可行方法來預防OIPN，嚴重影響患者的生活質量及療效[1-2]。OIPN的主要癥狀為肢體末端的感覺異常、麻木、疼痛及遇冷加重等，歸屬中醫學"血痹"的范疇[3]，有研究[4]證實加味黃芪桂枝五物湯可減輕OIPN。氧化應激及線粒體損傷在OIPN的發病機制中處于重要的地位[2,5]。本研究通過OIPN大鼠模型，觀察加味黃芪桂枝五物湯對氧化應激及線粒體損傷的影響，探討加味黃芪桂枝五物湯預防OIPN的作用機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選取健康WISTA雌鼠40只(購自南京君科生物工程有限公司)，體重180～220 g。飼養于SPF級動物中心，恒溫恒濕，每天8：00～20：00開燈，保證大鼠休息規律。本研究經過醫院倫理委員會審核通過。

1.1.2 實驗藥物 加味黃芪桂枝五物顆粒由黃芪20 g、桂枝10 g、白芍10 g、當歸10 g、大棗10 g、生姜10 g組成(購自江陰天江藥業有限公司)，加入80℃水至25 mL，混勻至殘渣消失，備用。奧沙利鉑注射液50 mg(購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：191226AN)；谷胱甘肽注射液 1.2 g(山東綠葉制藥有限公司，批號：190901205)。

1.1.3 主要實驗儀器及試劑 低溫高速離心機及熒光酶標儀購自德國Eppendorf；Mini-PROTEAN電泳系統以及MiniTrans-Blot轉印系統購自美國Bio-Rad；紫外分光光度計購自美國Beckman；二氧化碳培養箱購自YILIANG；水平脫色搖床購自華利達；ROS試劑盒購自碧云天；特級胎牛血清及PCR試劑盒購自美國ThermoPierce；疼痛觸覺測試套件購自美國Stoelting。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及造模 將40只WISTA雌鼠隨機分為空白組、模型組、谷胱甘肽(GSH)組、加味黃芪桂枝五物湯組，每組各10只。空白組給予相同體積溶劑 (5%葡萄糖溶液) 腹腔注射，模型組、加味黃芪桂枝五物湯組(中藥組)和GSH組按照Cheng等[6]方法進行OIPN大鼠造模[在第1、2、8、9、15、16、22、23 d時重復腹腔注射奧沙利鉑溶液(2.5 mg/kg，5%葡萄糖溶液稀釋)]，GSH組在化療當天及前后2 d分別給予谷胱甘肽1.5 g/m2/d尾靜脈注射。

1.2.2 給藥 加味黃芪桂枝五物湯灌胃給藥(10 mL/kg,1次/日)，空白組、模型組、GSH組予0.9%生理鹽水灌胃(10 mL/kg,每日1次)。奧沙利鉑用藥當天，中藥于奧沙利鉑應用前1 h給藥。

1.2.3 檢測指標 ①機械疼痛觸覺檢測：在第0、7、14、21、28 d運用VonFrey試驗檢測大鼠機械縮足反射閾值。②脊髓過氧化酶活性及產物檢測：奧沙利鉑造模后第28 d稱重，每組選擇5只大鼠處死，大鼠背根神經節取出后再取出脊髓研碎，加入生理鹽水混勻離心，取上清檢測超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶活性(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)及丙二醛(Malonic dialdehyde,MDA)含量。③背根神經節細胞的ROS熒光測定 造模第28 d稱重，麻醉后取大鼠L4-5背根神經節(Dorsalrootganglion，DRG)，制成細胞懸液并離心收集DRG細胞，進行PBS進行重懸→裝載熒光探針→培育→混勻→洗滌細胞→冰凍切片，顯微鏡觀察并計量熒光強度。④p53和p53相關線粒體凋亡蛋白表達水平測定：對DRG樣品進行總蛋白的提取→總蛋白定量→SDS-PAGE電泳分析→蛋白質轉膜→轉印膜封閉→一抗(p53、PUMA、Bax、Bcl-2、cytoc、cleavedcaspase-3、cleavedPARP1、GAPDH)雜交→T-TBS漂洗→二抗(Goatanti-MouseIgG(H+L)Secondaryantibody、Goatanti-RabbitIgG(H+L)Secondaryantibody、Rabbitanti-GoatPolyclonal(HRP) Antibody)雜交→T-TBS漂洗。采用SuperSignal?WestDuraExtendedDurationSubstrate，按說明書制備約1mlECL工作液，室溫孵育轉印膜，去除多余ECL試劑，予以保鮮膜密封，然后在暗盒中放上X-rayfilm曝光5～10 m后進行顯影和定影。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時間機械性縮足閾值變化 模型組第7 d即出現機械性縮足閾值下降(P<0.05)，并隨著時間延長逐漸加重，第21、28 d顯著下降，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.01)。加味黃芪桂枝五物湯組及GSH組優于模型組(P<0.05)，且加味黃芪桂枝五物湯組優于GSH組(P<0.05)，表明其可降低OIPN引起的大鼠機械性縮足閾值且優于GSH。見圖1。

圖1 加味黃芪桂枝五物湯對大鼠機械性縮足反射閾值的影響Figure 1 Effect of Modified Huangqi Guizhi Wuwu Decoction on the threshold of mechanical foot contraction reflex in rats

2.2 各組大鼠脊髓過氧化酶活性及產物含量 第28 d測各組SOD、GSH-Px活性及MDA含量，結果顯示模型組SOD、GSH-Px活性顯著低于空白組，MDA含量顯著高于空白組(均P<0.01)，表明OIPN存在顯著的氧化應激狀態導致DRG損傷；加味黃芪桂枝五物湯組及GSH組在SOD、GSH-Px活性及MDA含量均優于模型組(P<0.01)，加味黃芪桂枝五物湯組SOD、GSH-Px活性及MDA含量與GSH組相比差異無統計學意義(P>0.05)，表明加味黃芪桂枝五物湯可減輕奧沙利鉑引起的大鼠脊髓氧化應激反應，與GSH能力相當。見表1。

表1 各組大鼠脊髓過氧化相關酶活性及產物含量比較(U/mg)Table 1 Comparison of activity and product content of peroxidation related enzymes in rat spinal cord

2.3 各組大鼠DRG細胞的ROS生成影響 第28 d取出大鼠L4-5背根神經節，經處理后于顯微鏡觀察并計量熒光強度來評定各組ROS生成的影響，結果顯示GSH組及加味黃芪桂枝五物湯組熒光強度顯著低于模型組(P<0.01)，GSH組與加味黃芪桂枝五物湯相比二者熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)，表明加味黃芪桂枝五物湯可降低OIPN大鼠DRG細胞ROS生成，見圖2。

圖2 各組大鼠DRG細胞的ROS生成的影響Figure 2 Effect of Modified Huangqi Guizhi Wuwu Decoction on ROS production of DRG cells

2.4 加味黃芪桂枝五物湯對DRG細胞P53蛋白表達的影響 加味黃芪桂枝五物湯對線粒體凋亡關鍵蛋白P53表達的影響，分離L4-5 DRG，加味黃芪桂枝五物湯可以顯著降低P53蛋白的表達(P<0.01)，GSH組與加味黃芪桂枝五物湯組曝光強度比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果提示抑制P53的表達，可能是加味黃芪桂枝五物湯減少背根神經節損傷預防 OIPN的重要機制。見圖3、圖4。

圖4 各組DRG細胞P53蛋白表達曝光強度比較Figure 4 Comparison of exposure intensity of P53 protein expression in DRG cells of each group

2.5 加味黃芪桂枝五物湯對DRG細胞P53-Bax信號通路關鍵蛋白表達的影響 為進一步了解P53通路相關的線粒體凋亡途徑在加味黃芪桂枝五物湯防治OIPN的作用機制，對P53相關蛋白的表達進行進一步研究，發現加味黃芪桂枝五物湯可以顯著降低P53-Bax通路Bax及Caspase-3蛋白的表達，提高Bcl-2蛋白的表達(P<0.01)，GSH組與加味黃芪桂枝五物湯曝光強度相比差異無統計學意義(P>0.05)。結果提示P53-Bax通路受抑制，可能是加味黃芪桂枝五物湯抑制背根神經節線粒體凋亡的重要機制。見圖5、圖6。

圖5 加味黃芪桂枝五物湯對DRG細胞P53-Bax信號通路關鍵蛋白表達的影響Figure 5 Effect of Jiawei Huangqi Guizhi Wuwu Decoction on the expression of key proteins of P53 Bax signal pathway in DRG cells

圖6 各組DRG細胞P53-Bax信號通路關鍵蛋白表達曝光強度比較Figure 6 Comparison of exposure intensity of key protein expression of P53-Bax signal pathway in DRG cells of each group

3 討論

2020年，全球新發癌癥約1900萬，我國的新發癌癥病例也達到了450萬[7-8]，需要一線化療的患者數量將增加53%，從2018年的980萬增加到2040年的1500萬[9]。化療導致的CIPN是臨床常見的藥物劑量限制性不良反應，因此，CIPN的發病將大大增加。CIPN發生率較高，在所有患者中大于60%，長期遭受CIPN折磨的患者約有20%～30%[10-11]。奧沙利鉑在消化系統腫瘤中廣泛使用，尤其是結直腸癌的化療中尤為重要，但對于使用奧沙利鉑化療的患者，發生OIPN的幾率遠高于其他藥物，可達到76%～90%[12-13]。OIPN的發生導致了部分患者不得不減少奧沙利鉑的用量甚至停藥，嚴重影響了患者的生存及生活質量，增加了社會及家庭負擔。

OIPN的發生機制尚不明確，雖然目前國內外開展了多種藥物防治OIPN的臨床研究，如鈣鎂合劑、普瑞巴林、神經節苷脂、乙酰-l-左旋肉堿、甲鈷胺、加巴噴丁、維生素E、鈣錳福地吡等，但仍無明確的防治效果，且部分藥物可能出現不可預測的風險甚至導致腫瘤進展[14-16]。因OIPN發生后尚無有效逆轉方法，目前國內外指南無推薦使用的預防藥物[2]。

黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》，由黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗組成，是治療的血痹的特效方，具有益氣溫經、和營通痹的傳統功效，多項研究表明其可降低急、慢性OIPN的發生率并減輕其引起的麻木、疼痛、冷刺激過敏等相關癥狀，可修復OIPN所致的大鼠背根神經節的損傷[17-19]。因OIPN屬血痹氣虛血瘀型，手術及化療可導致血虛，加味黃芪桂枝五物湯為黃芪桂枝五物湯加用當歸組成，是治療OIPN經驗方。在臨床觀察有效的基礎上，本人前期開展了加味黃芪桂枝五物湯預防OIPN 的多中心RCT研究，共納入56例大腸癌根治術后輔助化療患者，結果顯示加味黃芪桂枝五物湯可減輕OIPN癥狀，并可推遲慢性疼痛出現的時間，減輕奧沙利鉑引起的外周神經損傷[20]。

DRG是四肢感覺傳導的初級神經元，具有傳輸和調節機體感覺、接受和傳導傷害性感受的功能。奧沙利鉑主要是通過損傷DRG上感官神經元，其發生率及病情程度與劑量強度、累積劑量、治療進度、給藥持續時間等密切關[21-22]。鉑類藥物通可過破壞DRG線粒體結構和生物能量學、增加硝基氧化應激和改變線粒體運輸、分裂、融合和有絲分裂吞噬而導致周圍感覺神經線粒體損傷，從而出現相關的周圍神經毒性癥狀[23-24]。鉑類是通過何途徑損傷DRG的線粒體，研究[25-27]顯示多個途徑可能參與了DRG線粒體損傷，其中P53-Bax通路是DRG線粒體損傷中重要的途徑。

目前針對DRG細胞凋亡保護研究極少，尤其是基于P53-Bax通道暫無系統研究，本實驗為預防OIPN這一腫瘤治療領域難點提供新的思路，也為預防OIPN的藥物研發奠定一定基礎，但加味黃芪桂枝五物湯如何調控P53-Bax通道，抑制氧化應激與抑制P53-Bax通道是否相關，這些問題尚不清楚，需進一步研究明確。

本實驗成功建立OIPN模型，并從氧化應激及P53-Bax通道介導的線粒體損傷途徑共同探討了加味黃芪桂枝五物湯對OIPN的防治作用，結果顯示加味黃芪桂枝五物湯可降低OIPN引起的大鼠機械性縮足閾值且優于GSH；降低OIPN大鼠DRG細胞ROS生成，減輕奧沙利鉑引起的大鼠脊髓氧化應激反應；抑制P53的表達，降低P53-Bax通路Bax及Caspase-3蛋白的表達，提高Bcl-2蛋白的表達。結果表明加味黃芪桂枝五物湯可通過減輕奧沙利鉑引起的大鼠脊髓氧化應激反應，并通過P53-Bax通路減輕線粒體損傷從而防治OIPN。

4 結論

本研究結果提示，加味黃芪桂枝五物湯可通過抗氧化應激及抑制P53-Bax通路誘導的DRG細胞線粒體損傷來預防OIPN。