基于指紋圖譜研究金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒相關性

張輝，許樹萍，黃凱偉，趙偉志，鄭曉英，譚沛

（1.華潤三九醫藥股份有限公司，廣東深圳 518110；2.華潤三九現代中藥制藥有限公司，廣東惠州 516000）

金櫻子為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigataMichx.的干燥成熟果實，為花托發育而成的假果，呈倒卵形，切開后，花托壁厚，內有多數堅硬的小瘦果，內壁及瘦果均有淡黃色絨毛[1]。金櫻子最早載于南北朝《雷公炮炙論》，在歷代本草與古籍文獻中，除南北朝為同名異物外，此后多以金櫻子為正名，并記載有別名。金櫻子味酸澀，性溫、平，歸脾、腎、肺、膀胱經，具有滋補益氣的保健功效[2]?，F代研究表明，金櫻子含有黃酮、三萜、鞣質、苯丙素、甾體、多糖類等化學成分；具有收澀止瀉、免疫調節、抗氧化、抗菌抗炎、抗腫瘤、保肝護腎、降血脂、保護神經等生物活性；可用于治療糖尿病腎病、慢性腎炎蛋白尿、遺精遺尿、特發性血小板減小性紫癜、慢性頑固性腹瀉等疾病[3]。金櫻子肉的炮制工藝為：取凈金櫻子，略浸，潤透，縱切兩瓣，除去毛、核，干燥，制得金櫻子肉飲片?！吨袊幍洹访鞔_規定金櫻子的飲片為金櫻子肉，而非金櫻子，目前國內臨床使用以及文獻報道上，對金櫻子藥材的飲片認識存在不足，使用上存在錯誤的情況[1]。本研究將首次對金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒指紋圖譜進行研究。

目前，對金櫻子藥材和配方顆粒指標成分含量的相關質量控制研究報道較多，而對金櫻子肉的相關研究報告較少。中藥標準湯劑是在中醫藥理論的指導下，作為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的物質基礎。金櫻子肉配方顆粒是以金櫻子肉飲片為原料，經過提取、分離、濃縮、干燥、制粒、包裝等生產工藝加工制成供中醫臨床配方用的顆粒。本研究采用高效液相色譜法建立了金櫻子肉配方顆粒的指紋圖譜，并考察分析金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒之間的相關性和差異性，進而有效提高金櫻子肉配方顆粒的質控水平和整體質量，也為金櫻子肉配方顆粒替代傳統飲片的可行性研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters（Alliance2695 型）高效液相色譜儀；XS204、XS205、XSE205 萬分之一天平（瑞士梅特勒）、ME36S 百萬分之一天平（瑞士梅特勒）、超聲儀（上?？茖С晝x器有限公司）、水浴鍋。

1.2 試藥

沒食子酸（批號：110831-201605，純度90.8%）、鞣花酸（批號：111959-201602，純度89.3%）對照品、金櫻子對照藥材（批號：121047-201204）均購于中國食品藥品檢定研究院；鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷（批號：22012502）購于上海詩丹德標準技術服務有限公司；槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸（批號：080097-202111）購于上海鴻永生物科技有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水；其他試劑均為分析純。

15 批金櫻子藥材產地分別來自安徽省（A1-A3）、江西?。ˋ4-A6）、湖南?。ˋ7-A9）、貴州?。ˋ10-A12）、廣東?。ˋ13-A15），經安徽中醫藥大學的劉守金教授鑒定為金櫻子Rosa laevigataMichx.的干燥成熟果實。15批金櫻子肉飲片（樣品編號B1-B15）嚴格按照2020 年版《中國藥典》一部金櫻子項下飲片炮制規定進行炮制[1]：取凈金櫻子，略浸，潤透，縱切兩瓣，除去毛、核，干燥，制得金櫻子肉飲片。15 批金櫻子肉飲片標準湯劑（樣品編號C1-C15）嚴格按照《醫療機構中藥煎藥室管理規范》和《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》中煎藥方法進行制備：取金櫻子肉飲片，提取制得標準湯劑，為了標準湯劑的長期儲存，根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》，進行低溫減壓濃縮，冷凍干燥，得金櫻子肉飲片標準湯劑凍干粉。15 批金櫻子肉配方顆粒（樣品編號為D1-D15）由水提取，濃縮、干燥、制粒等步驟得到。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑色譜柱：Waters AtlantisTMT3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫（0 min：3%A-97%B；35 min：25%A-75%B；40 min：40%A-60%B；檢測波長為260 nm；柱溫30 ℃）；流速為1.0 mL/min；進樣量10 μL。

2.2 參照物溶液的制備

取金櫻子對照藥材約2.0 g，置具塞錐形瓶中，加入水50 mL，加熱回流45 min，放冷，濾過，濾液蒸干，加入70%甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得對照藥材參照物溶液。取沒食子酸、鞣花酸-4-Oα-L-阿拉伯糖苷、鞣花酸、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶液分別制成每1 mL含對照品20μg的溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 金櫻子肉飲片供試品溶液 取金櫻子肉飲片粉末約2.0 g，置具塞錐形瓶中，加入水50 mL，加熱回流45 min，放冷，濾過，濾液蒸干，加入70%甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.2 金櫻子肉飲片標準湯劑凍干粉供試品溶液取金櫻子肉飲片標準湯劑凍干粉約0.8 g，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，濾過，取續濾液，即得。

2.3.3 金櫻子肉配方顆粒供試品溶液 取金櫻子肉配方顆粒適量，研細，取約0.8 g，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取陰性溶液、參照物溶液及供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，結果見圖1-6。可見供試品溶液色譜峰與參照物溶液色譜峰保留時間相對應，且陰性溶液對供試品溶液色譜各特征峰無干擾，表明該分析方法專屬性良好。

圖1 供試品溶液（配方顆粒）和沒食子酸（峰1）、鞣花酸（峰7）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸（峰8）對照品色譜圖Figure 1 Chromatograms of test solution (formula granules) and reference substances of gallic acid(peak 1),ellagic acid(peak 7),quercetin-3-O-β-D-glucopyranosylic acid(peak 8)

圖2 供試品溶液（配方顆粒）和鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷（峰6）對照品色譜圖Figure 2 Chromatograms of test solution (formula granules)and reference substance of ellagic acid-4-O-α-L-arabinoside(peak 6)

圖3 供試品溶液HPLC色譜圖Figure 3 The HPLC chromatograms of test solution

圖4 金櫻子對照藥材HPLC色譜圖Figure 4 The HPLC chromatogram of Rosa laevigata reference material

2.4.2 精密度試驗 取同一份金櫻子肉配方顆粒（D4）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，測定各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果各特征峰與參照物S 峰（7 號峰）的相對保留時間以及相對峰面積的RSD范圍分別為0.01%～0.10%和0.13%～1.51%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一份金櫻子肉配方顆粒（D4），按“2.3.4”項的供試品制備方法重復制備6份，并且按照“2.1”項下色譜條件測定各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果各特征峰與參照物S 峰（7 號峰）的相對保留時間及相對峰面積的RSD范圍分別為0.01%～0.16%和2.03%～2.95%，表明該方法的重復性良好。

圖5 金櫻子對照藥材與供試品溶液HPLC色譜圖Figure 5 The HPLC chromatograms of Rosa laevigata reference material and test solutions

圖6 陰性溶液HPLC色譜圖Figure 6 The HPLC chromatogram of negative solution

2.4.4 穩定性試驗 取同一份金櫻子肉配方顆粒（D4）供試品溶液，按按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、18、24 h 進樣，測定各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果各色譜峰與參照物S 峰（7號峰）的相對保留時間及相對峰面積的RSD范圍分別為0.01%～0.12%和0.38%～3.58%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5 指紋圖譜及其參數的建立與相似度評價

2.5.1 指紋圖譜及其參數的建立 分別取15批金櫻子肉飲片、15 批標準湯劑、15 批配方顆粒，按“2.3”項方法分別制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用藥典委員會編制的指紋圖譜相似度評價軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012 版”，用15 批金櫻子肉飲片、15 批金櫻子肉標準湯劑、15 批金櫻子肉配方顆粒分別生成對照指紋圖譜R1、R2、R3（圖7-9）；色譜匹配之后，得到8個響應值較合適、分離度較好、純度較高的共有特征峰（圖10-12）。通過查閱文獻，對金櫻子肉配方顆粒各個特征峰的化學性質進行分析，選用沒食子酸、鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷、鞣花酸、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸對照品對其進行定位指認，確定1號峰為沒食子酸，6號峰為鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷，7 號峰為鞣花酸，8 號峰為槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸。

圖7 金櫻子肉飲片對照指紋圖譜Figure 7 The fingerprint of Rosa laevigata fructus

圖8 金櫻子肉標準湯劑對照指紋圖譜Figure 8 The fingerprint of Rosa laevigata fructus standard decoction

圖9 金櫻子肉配方顆粒對照指紋圖譜Figure 9 The fingerprint of Rosa laevigata fructus formula granules

圖10 15批金櫻子肉飲片指紋圖譜Figure 10 Fingerprints of 15 batches of Rosa laevigata fructus

2.5.2 相似度評價研究 用藥典委員會編制的指紋圖譜相似度評價軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012 版”，將15 批金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒指紋圖譜導入并計算各批次與其對照圖譜的相似度，結果見表1。結果表明15 批金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒的指紋圖譜與其相應對照指紋圖譜（R1、R2、R3）的相似度均大于0.95，表明不同批次金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒的質量較為穩定。

表1 15批金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒指紋圖譜相似度結果Table 1 Results of similarity analysis of 15 batches of Rosa laevigata fructus pieces,standard decoction and formula granules

圖11 15批金櫻子肉標準湯劑指紋圖譜Figure 11 Fingerprints of 15 batches of Rosa laevigata fructus standard decoction

圖12 15批金櫻子肉配方顆粒指紋圖譜Figure 12 Fingerprints of 15 batches of Rosa laevigata fructus formula granules

2.5.3 對照指紋圖譜的比較 將15 批金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒指紋圖譜生成的對照指紋圖譜R1、R2、R3（見圖13）分別導入軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012 版”，結果顯示：與金櫻子肉飲片比較，金櫻子肉標準湯劑和配方顆粒的相似度分別為0.991 和0.992，金櫻子肉標準湯劑和配方顆粒指紋圖譜相似度為1.000，表明金櫻子肉飲片、標準湯劑與配方顆粒成分基本一致，標準湯劑在提取、濃縮、干燥過程中，其成分種類無明顯變化。

圖13 金櫻子肉飲片對照指紋圖譜（R1）、標準湯劑對照指紋圖譜（R2）和配方顆粒對照指紋圖譜（R3）Figure 13 Reference fingerprints of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules by HPLC

2.6 化學模式識別研究

2.6.1 共有峰相關性分析 采用SPSS 26.0 軟件，以15批金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒共45個樣品各特征峰的峰面積值為變量進行皮爾遜相關性分析，結果見表2?？梢?，45個樣品中色譜峰峰1（沒食子酸）和峰5，峰2 和峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷）均具有顯著的正相關性；峰2 和峰3、峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸），峰3 和峰5、峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷）、峰7（鞣花酸）、峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸）；峰5 和峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷）、峰7（鞣花酸）、峰8（槲皮素-3-O-β-L-吡喃葡糖苷酸）；峰6 和峰7（鞣花酸）、峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸）均具有極顯著的正相關性。

表2 15批金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒指紋圖譜共有峰的相關性分析結果Table 2 Correlation analysis results of common peaks of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

2.6.2 聚類分析 采用SPSS 26.0 軟件，以15 批金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒共45個樣品各特征峰面積為變量進行聚類分析，結果見圖14?？梢姡斁嚯x為10 時，45 批樣品可以分為4 類，B4-B7、B14、B15、C1-C15、D1-D3、D7-D15 聚為一類，B1-B3、B8-B11 聚為一類，D4-D6 聚為一類，B12、B13聚為一類。表明飲片、標準湯劑、配方顆粒三者之間無顯著性差異，且標準湯劑與配方顆粒更為接近。

圖14 金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜聚類分析樹狀圖Figure 14 The cluster analysis tree of Rosa laevigata fructus,standard decoction,formula granules

2.6.3 主成分分析（PCA）采用SPSS 26.0 軟件，對15批金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒共45個樣品各特征峰面積的標準化值（Xi）進行主成分分析，主成分結果以特征值＞1 為標準提取得到2 個主成分，計算得特征值和方差貢獻率見表3，主成分因子載荷矩陣見表4。由結果可知，前2個主成分累積貢獻率為72.13%，表明提取的2 個主成分能反映金櫻子肉指紋圖譜的大部分信息。主成分1的特征值為4.176，方差貢獻率為52.20%，載荷較高的峰有峰3、峰4、峰5、鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷、鞣花酸和槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸，表明這6 個峰主要反映主成分1的信息；主成分2的特征值為1.594，方差貢獻率為19.92%，載荷較高的峰有沒食子酸、峰2，表明這2個峰主要反映主成分2的信息。

根據表3 和表4 的數據，由公式Fi=Wi1X1+Wi2X2+…….+WijXj（W為主成分中各個變量的權重，由成分矩陣中的第j列載荷除以對應成分特征值的算術平方根所得），計算得到主成分得分F1、F2，主成分得分圖見圖15。

圖15 金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜主成分得分圖Figure 15 PCA score plot of principal component analysis of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

表3 金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒主成分分析特征值及方差貢獻率Table 3 Characteristic values and variance contribution rates of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

表4 金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒主成分因子載荷矩陣Table 4 Principal component factor load matrix of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

2.6.4 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）采用SIMCA 14.1 軟件，以15 批金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒共45 個樣品各特征峰峰面積為變量進行OPLS-DA 分析，結果見圖16-17。由模型參數可知，數據矩陣的解釋率參數R2X（cum）=0.460，模型區分參數R2Y（cum）=-0.005 7，模型預測參數Q2=-0.226，均符合要求，表明該數學模型穩定可靠。45個樣品可分成4類。以VIP值＞1為提取標準，得到峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸）、峰3、峰2、峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷）是影響分類的主要標志性成分。

圖16 金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒HPLC指紋圖譜OPLS-DA得分圖Figure 16 OPLS-DA score plot of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

圖17 金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒HPLC 指紋圖譜VIP值Figure 17 Results of VIP values of Rosa laevigata fructus,standard decoction and formula granules

3 討論

本研究參照《醫療機構中藥煎藥室管理規范》和《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》，對制備工藝關鍵參數進行考察研究?？疾祜嬈屎筒煌铀?，確定金櫻子肉標準湯劑煎煮加水量為一煎加水8 倍量和二煎加水6 倍量，并通過古文中醫藥著作和現代臨床的使用情況，確定標準湯劑的煎煮工藝為：冷浸30 min，煎煮兩次，一煎加8 倍量水，煎煮30 min，二煎加6 倍量水，煎煮25 min?？疾觳煌繑禐V材，選擇200 目濾布作為湯劑的過濾方式。對不同濃縮溫度的影響考察，確定了減壓濃縮過程中濃縮溫度控制在55～65 ℃，并且確定真空度和濃浸膏相對密度等參數，并且采用冷凍干燥制備成金櫻子肉標準湯劑。為了確保顆粒和標準湯劑的一致性，配方顆粒制備工藝參數與標準湯劑的制備工藝參數保持一致。

金櫻子中主要含有多糖類、黃酮類、鞣質等成分，本實驗以相關文獻結果[4-9]為導向，針對其主要成分展開指紋圖譜方法研究，通過對比不同波長的色譜圖，發現當檢測波長為260 nm 時，色譜圖基線平穩且各特征峰響應值較高；且考察過程中發現采用乙腈∶0.1%磷酸溶液流動相洗脫、在流速1.0 mL/min和柱溫30 ℃條件下，各色譜峰分離效果最好。同時，考慮到樣品制備方法對指紋圖譜的建立影響較大，選取了純水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇作為提取溶劑，結果表明，選擇70%甲醇作為提取溶劑時，指紋圖譜得到的色譜峰信息量較大，峰型較好，系統適應性參數相對較優；并考察了超聲提取和加熱回流不同提取方式，結果顯示提取方式對指紋圖譜的影響較小，在此基礎上，考察了提取時間30～60 min，在該范圍內，各特征成分能被完全提取，綜合考慮，選擇45 min 為提取時間。對取樣量0.4～1.0 g 進行考察，當金櫻子肉標準湯劑取樣量為0.8 g 時，色譜峰的響應值相對均衡，因此，取樣量確定均為0.8 g。

本試驗確定的金櫻子肉配方顆粒8個特征共有峰在飲片、標準湯劑的色譜圖中均可找到對應峰，并指認了其中的1、6、7、8號峰，分別為沒食子酸、鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷、鞣花酸和槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸；相似度評價結果顯示，15 批金櫻子肉飲片、標準湯劑、配方顆粒指紋圖譜與相應對照指紋圖譜的相似度均大于0.950，三者對照指紋圖譜的相似度均大于0.990；皮爾遜相關性分析檢驗了共有峰兩兩之間的關系強度，表明大部分共有峰成顯著相關關系，說明金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒在化學成分類型以及成分的含量上沒有明顯的差異。主成分分析（PCA）則通過少數幾個主成分來解釋多個共有峰間的內部結構，體現批次間的可視化，共有峰間相關程度越高，主成分分析效果越好，結果顯示，兩個主成分的累計方差貢獻率為72.13%，金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒三者沒有明顯差異，且標準湯劑與配方顆粒的相似度較高。聚類分析均表明三者沒有明顯的差異，但標準湯劑與配方顆粒的質量更為相近，說明配方顆粒制備工藝參數的合理性和穩定性，配方顆粒生產制備過程中，各特征峰均能穩定性傳遞，沒有發生明顯的降解或者增加的情況，制得的配方顆粒的質量水平與傳統標準湯劑基本一致。OPLS-DA 將45 個樣品分為4 類，并篩選出4 個VIP 值大于1 的差異性成分峰8（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡糖苷酸）、峰3、峰2、峰6（鞣花酸-4-O-α-L-阿拉伯糖苷），目前2020 年版《中國藥典》“金櫻子”項下尚未有含量測定項目，而關于金櫻子的含量測定的報道也比較少，因此，計劃下一步從該4 個特征性成分出發，建立專屬性的含量測定方法，進一步評價金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒含量的相關性。

試驗中發現，金櫻子對照藥材指紋圖譜，在特征峰的個數上與金櫻子肉指紋圖譜一致，說明了兩者在化學成分的一致，含有毛、核等部位的金櫻子對照藥材圖譜中，沒有其他明顯的特征峰的出現，說明了金櫻子的有效成分主要在金櫻子肉的部位，證明藥典飲片炮制中“除去毛、核”等步驟的合理性，后續將結合含量測定，進一步對金櫻子和金櫻子肉的差異進行深入的對比研究。

本研究采用高效液相色譜法建立金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒指紋圖譜，該方法專屬性強，重復性好，采用多種統計方法對金櫻子肉飲片、標準湯劑和配方顆粒三者的相關性進行分析，結果表明三者的相關性較好，采用該指紋圖譜技術，可以用于金櫻子肉配方顆粒生產制備過程中從原料到成品階段的質量有效控制。