桑枝不同部位超高效液相特征圖譜建立及化學模式識別研究

鄧李紅，陳仕妍，王壽富，林偉雄，張雪蘭，邱彩月，黃貴發，張正

（1.廣東一方制藥有限公司，廣東佛山 528244；2.廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東佛山 528244）

桑枝始載于《本草圖經》[1]，為桑科桑屬植物桑Morus albaL.的干燥嫩枝，味微苦，性平，入肝經，具有祛風濕、利關節功效，可治療風濕痹病、肩臂、關節酸痛麻木等癥，臨床上常用于治療肩臂關節腫痛、四肢痙攣和肌體風癢等疾病[2-3]。桑枝的資源非常豐富，在全國各地均有分布，但主產于浙江、安徽、江蘇、湖南等地[4]，一般春末夏初采收，呈長圓柱形，少有分枝，長短不一，從結構上可分為木質部和韌皮部兩部位，各約占全桿桑枝的72%、27%，另髓芯部約占1%[5]。現代研究表明，桑枝主要含有黃酮類、生物堿類、木質素類、果膠類、多糖類等化學成分[6-8]，不同部位化學成分差異較大，如木質素和多糖類在木質部中的含量占比略高，而韌皮部中則含有較多的果膠類成分[9]。為進一步探究桑枝不同部位的化學成分差異，彌補《中國藥典》2020 年版桑枝項下僅有性狀和顯微鑒別，而無相關化學成分定性定量分析的空白。本研究通過建立超高效液相色譜法，獲得桑枝及其不同部位全面系統的超高效液相特征圖譜，運用方差分析、熱圖和聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析等化學模式識別方法對超高效液相特征圖譜中的多指標變量進行統計分析，深入研究桑枝不同部位主要特征性成分的差異，對完善桑枝質量標準修訂及今后桑枝資源綜合開發利用具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

Waters H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；ME204E 型、XP26 型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；KQ-500DE 型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；MiliQ Direct 8 型超純水機（德國Merck 有限公司）。

1.2 藥品與試劑

桑皮苷A 對照品（純度≥98%，批號18052901，購自成都普菲德生物技術有限公司）；綠原酸對照品（純度：96.30%，批號110753-202119，購自中國食品藥品檢定研究院）；隱綠原酸對照品（純度：99.30%，批號DST220104-035，購自成都德斯特生物技術有限公司）；乙腈為色譜級（默克公司），其余試劑為分析純，水為超純水。10 批桑枝藥材（編號S1-S10）經廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定為桑科植物桑Morus albaL.的干燥嫩枝，來源信息詳見表1。將10 批桑枝藥材不同部位分開，分別得木質部芯桿（編號G1-G10）、韌皮部皮（編號P1-P10）。

表1 10批桑枝來源信息Table 1 Source information of 10 batches of Ramulus Mori

2 方法與結果

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%磷酸，梯度洗脫（0～2 min，9%～13%A；2～6 min，13%～14%A；6～7 min，14%～23%A；7～18 min，23%～40%A；18～19 min，40%～68%A；19～20 min，68%～9%A）；檢測波長：320 nm；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱定桑皮苷A、綠原酸、隱綠原酸對照品，加50%甲醇制成每1 mL分別含86.05 μg桑皮苷A、98.90 μg綠原酸、88.48 μg隱綠原酸的溶液，作為對照品參照物溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取桑枝樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）處理15 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失質量，搖勻，采用0.22 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 精密度考察 取桑枝藥材粉末適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件檢測樣品，重復進樣6 次，以2 號峰桑皮苷A為參照峰（S），計算得到各特征峰相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA）的RSD均小于3%，提示儀器精密度良好。

2.2.5 重復性考察 取桑枝藥材粉末適量，平行6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測樣品，以2 號峰桑皮苷A 為參照峰（S），計算得到各特征峰RRT 和RPA 的RSD均小于3%，提示該方法重復性良好。

2.2.6 穩定性考察 取桑枝藥材粉末適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h 按照“2.2.1”項下色譜條件檢測樣品，以2 號峰桑皮苷A 為參照峰（S），計算得到各特征峰RRT 和RPA 的RSD 均小于5%，提示供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.7 桑枝特征圖譜的建立 按“2.2.3”項下方法制備10批桑枝藥材供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件檢測，采集色譜圖，將其導入國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件中進行色譜圖匹配，建立桑枝藥材的特征圖譜。以S1圖譜作為參照圖譜，時間窗寬度設置為0.1 min，經多點校正、全譜峰匹配、中位數法生成10批桑枝藥材的共有特征圖譜及對照特征圖譜，10 批桑枝藥材共有特征圖譜中共標定了共有峰11個，通過對照品比對，指認了2 號峰為桑皮苷A、4 號峰為綠原酸、5 號峰為隱綠原酸，詳見圖1、2。計算10 批桑枝藥材特征圖譜與生成的共有對照特征圖譜的相似度為0.936、0.971、0.859、0.989、0.994、0.865、0.982、0.940、0.924、0.898，表明不同批次桑枝樣品間質量一致性整體較好。

圖1 10批桑枝藥材共有特征圖譜Figure 1 Common characteristic chromatograms in 10 batches of Ramulus Mori

2.2.8 桑枝不同部位特征圖譜評價 按“2.2.3”項下方法制備10批桑枝芯桿及皮兩部位的供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件檢測，采集色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件中進行色譜圖匹配，分別以G1、P1 圖譜作為參照圖譜，經多點校正、全譜峰匹配生成10批桑枝芯桿及皮兩部位的共有特征圖譜，同時采用中位數法分別生成對照特征圖譜，10 批桑枝芯桿及皮共有特征圖譜中均標定了11 個共有峰。共有特征圖譜詳見圖3，對照特征圖譜詳見圖4。

圖2 桑枝藥材對照圖譜和對照品圖譜Figure 2 Reference characteristic chromatogram of Ramulus Mori and chromatograms of mixed reference substances

圖3 桑枝芯桿（A）和皮（B）共有特征圖譜Figure 3 Common characteristic chromatograms of Ramulus Mori core rod(A)and bark(B)

圖4 桑枝芯桿和皮的對照特征圖譜Figure 4 Reference characteristic chromatograms of Ramulus Mori core rod and bark

2.3 化學模式識別分析

2.3.1 方差分析 采用SPSS 20.0 軟件對10 批桑枝藥材、芯桿和皮共有特征峰的單位峰面積（μAu*s/g）進行單因素方差分析。結果顯示，芯桿的峰3、5、10，皮的峰1、2、4、5、9-11 與藥材間的單位峰面積差異具有統計學意義（P＞0.05），表明藥材各特征峰的含量與芯桿接近，而與皮差異較大，或與芯桿在藥材占比較大有關；芯桿的峰1-4、11 與皮間的單位峰面積差異具有統計學意義，即桑枝皮中峰1-4的單位峰面積顯著大于桑枝芯桿，而桑枝皮中峰11的單位峰面積則顯著小于桑枝芯桿，此外峰5、6、9、10 的單位峰面積在芯桿中含量略高，峰7、8 的單位峰面積在皮中含量略高，表明桑枝不同部位含有的化學成分存在一定差異。10 批桑枝不同部位特征圖譜共有峰單位峰面積的方差分析結果見表2。

表2 桑枝不同部位樣品特征圖譜共有峰峰面積方差分析結果Table 2 Variance analysis of common peak area of different parts of Ramulus Mori(,n=10)

表2 桑枝不同部位樣品特征圖譜共有峰峰面積方差分析結果Table 2 Variance analysis of common peak area of different parts of Ramulus Mori(,n=10)

與藥材比較：aP＜0.05；與芯桿比較：bP＜0.05

2.3.2 熱圖和聚類分析 以11 個共有特征峰單位峰面積為變量，采用對數歸一化方式，以Euclidean 平方距離為度量標準，使用HemI 1.0軟件對10批桑枝藥材、芯桿和皮特征圖譜數據進行熱圖和聚類分析。熱圖分析結果顯示桑枝藥材、芯桿和皮間化學成分含量差異較大，其中桑枝皮1-4共有特征峰顏色偏暖，表明其所含各成分含量較藥材、芯桿高；桑枝皮9-11 共有特征峰稍偏冷，表明其所含各成分含量均較藥材、芯桿低；5～8 特征峰在桑枝藥材、芯桿和皮間顏色相近，表明其所含化學成分含量差異較小；除桑枝藥材的S8樣品與桑枝皮樣品聚在一起外，樣品聚類分析結果顯示桑枝藥材和芯桿可大致聚為Ⅰ類，桑枝皮大致聚為Ⅱ類，表明桑枝芯桿與藥材的一致性較高，且與皮區分明顯，如圖5所示。

圖5 桑枝不同部位的熱圖聚類分析圖Figure 5 Heat map and dendrogram of hierarchical cluster analysis of different parts of Ramulus Mori

2.3.3 PCA 分析 在聚類分析的基礎上，進一步采用主成分分析（PCA）對桑枝藥材、芯桿和皮樣品進行比較，通過數學降維的原理，從10批桑枝藥材、芯桿和皮樣品原數據中提取幾個具代表的綜合性指標來代替多個原始變量。PCA 分析結果中提取到4個特征值大于1 的主成分（PC），可用于反映桑枝藥材、芯桿和皮樣品特征圖譜86.08%以上信息，其中PC1 貢獻率為31.82%，貢獻率最大，PC2 貢獻率為27.28%，PC3 貢獻率為17.59%，PC4貢獻率為9.40%。由前3 個主成分建立坐標系，得到10 批桑枝藥材、芯桿和皮樣品的PCA得分圖（詳見圖6），由圖可見，桑枝藥材與芯桿聚為一類，桑枝皮單獨聚為一類，PCA 的整體區分與熱圖聚類分析結果一致。根據桑枝不同部位共有峰成分矩陣，主成分1的信息來自峰1、2、4、8，其中2號峰為桑皮苷A、4號峰為綠原酸；主成分2 的信息來自峰6、9、10、11；主成分3 的信息來自峰3、7；主成分4 的信息來自峰5隱綠原酸。詳見表3。

表3 桑枝不同部位成分矩陣Table 3 Composition matrix of different parts of Ramulus Mori

圖6 桑枝不同部位樣品的主成分分析得分圖Figure 6 Principal component analysis score plot of different parts of Ramulus Mori samples

以Y1，Y2，Y3、Y4 代表4 個主成分來作為10 批不同部位桑枝成分所表達的信息，建立桑枝不同部位品質評價模型，得出如下成分的線性關系表達式分別為Y1=F1*0.906+F2*0.890+F3*0.613+F4*0.649-F5*0.043+F6*0.359+F7*0.568+F8*0.747+F9*0.049-F10*0.231-F11*0.152；Y2=F1*0.041-F2*0.040-F3*0.031-F4*0.346+F5*0.570+F6*0.541+F7*0.178+F8*0.341+F9*0.818+F10*0.828+F11*0.870；Y3=F1*0.280-F2*0.324+F3*0.710+F4*0.553+F5*0.368+F6*0.202-F7*0.672-F8*0.530+F9*0.034+F10*0.181-F11*0.008；Y4=-F1*0.222+F2*0.155+F3*0.248-F4*0.279+F5*0.691+F6*0.055+F7*0.290-F8*0.085-F9*0.488-F10*0.049-F11*0.091。結合1、2、3、4 主成分方差貢獻率，桑枝藥材、芯桿和皮的綜合評價表達式Y綜合得分=（Y1*31.82+Y2*27.28+Y3*17.59+Y4*9.40）/86.08，根據以上公式得到桑枝藥材、芯桿和皮的綜合評價得分及排名，排名前10的樣品中桑枝皮占了7 批，排名前20 的樣品中桑枝藥材占了7 批、桑枝皮占了9 批，表明桑枝皮的化學成分綜合質量水平優于桑枝藥材及芯桿，桑枝藥材綜合質量水平則介于桑枝皮和芯桿之間。詳見表4。

表4 桑枝不同部位主成分得分及綜合得分排名Table 4 Ranking of principal component scores and comprehensive scores of different parts of Ramulus Mori

2.3.4 OPLS-DA 分析 為了進一步明確桑枝藥材、芯桿和皮樣品之間產生差異的主要標志物，基于主成分分析（PCA）結果，采用監督模式識別法進行桑枝藥材、芯桿和皮樣品間正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），計算出對差異貢獻較大的因素。以模型變量投影（VIP）值為指標對引起桑枝藥材、芯桿和皮樣品間差異的成分進行分析，篩選貢獻較大的6 個變量（以VIP 值＞1 為標準），分別為1 號峰（VIP=1.247）、10 號峰（VIP=1.171）、4 號綠原酸峰（VIP=1.134）、2 號桑皮苷A 峰（VIP=1.133）、3 號峰（VIP=1.072）和11 號峰（VIP=1.046），提示上述6 個成分是引起桑枝藥材、芯桿和皮樣品間成分差異的主要標志性成分，其余峰VIP 值小于1，對樣品的區分影響較小。詳見圖7。

圖7 桑枝不同部位樣品11個共有峰的VIP值Figure 7 VIP values of 11 common peaks of different parts of Ramulus Mori

3 討論

本研究通過建立桑枝不同部位超高效液相特征圖譜，結合方差分析、熱圖和聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析進行化學模式識別分析，能將桑枝芯桿與皮進行有效地區分。方差分析結果表明桑枝不同部位所含的化學成分存在較大差異，偏水溶性成分（峰1-4）含量主要富集在桑枝皮中，偏脂溶性成分（峰9-11）含量主要富集在桑枝芯桿中，這與熱圖分析結果桑枝皮1-4共有特征峰顏色偏暖，9-11 共有特征峰顏色偏冷相符。PCA 分析結果顯示桑枝藥材與芯桿聚為一類，桑枝皮單獨聚為一類，與熱圖聚類分析結果一致，進一步建立桑枝不同部位品質評價模型，表明桑枝皮的化學成分的綜合質量水平優于桑枝藥材及芯桿，或為桑枝不同結構組織上的差異導致主要化學成分的合成和積累不同，同時又因芯桿占藥材的絕大部分導致藥材質量與芯桿相似，故在藥材采收時應綜合考慮不同生長年限、不同直徑大小等因素下皮和芯桿主要化學成分的合成積累，另在藥材加工時也應注意對皮部的保留以確保藥材品質。OPLS-DA分析進一步明確了桑枝藥材、芯桿和皮樣品之間產生差異的6 個主要標志物，其中標志物之一桑皮苷A為二羥基芪類化合物，又稱為氧化白藜蘆醇苷，主要存在于桑屬植物中[10-11]，在桑枝藥材中質量分數相對較高，具有鎮咳平喘、抗炎鎮痛、抑制絡氨酸酶、抗氧化活性以及逆轉耐藥活性等多種作用[12-14]，作為評價桑枝不同部位差異及藥材質量控制的指標具有重要意義。

本研究建立的超高效液相特征圖譜和化學模式識別分析方法能較好地反映桑枝不同部位化學成分的分布規律及差異性。《中國藥典》2020 年版收載的桑枝來源為桑的嫩枝，規定其直徑應為0.5～1.5 cm，但未對嫩枝的生長年限做明確的規定[2]，劉善新等[15]通過比較不同生長年限桑枝中的黃酮成分，發現生長時間在半年內的桑枝，黃酮的總含量和種類均明顯少于生長時間1 年以上的桑枝，因此桑枝藥材質量控制應關注不同生長時期不同部位主要成分桑皮苷A 及其他化學成分的含量變化規律，同時結合藥效學及安全性評價開展進一步的系統研究。