清胰顆粒對重癥急性胰腺炎大鼠腎臟AQP4 蛋白表達(dá)及腎功能的影響

楊元生，葉東雯，彭衛(wèi)斌，陳墾，謝文瑞，容海鷹

（1.廣州新海醫(yī)院，廣東廣州 510300；2.廣東藥科大學(xué)臨床藥學(xué)院，廣東廣州 510310；3.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510800）

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是以炎癥反應(yīng)和胰腺自身消化為主要特征的臨床常見急腹癥，臨床診治不及時可進(jìn)展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）合并遠(yuǎn)處臟器損害，SAP 約占AP 的10%～20%，起病兇險，早期臟器功能損害以肝（76.4%）、肺（72.7%）和腎（45.5%）最多，盡管目前醫(yī)療水平提高后SAP 病死率有所下降，但仍高達(dá)10%[1-2]。因此，探討有效治療藥物是降低SAP 病死率的迫切需要。本課題組于2007 年由陳墾教授主持廣東省課題研制中藥復(fù)方清胰顆粒，清胰顆粒含大黃、丹參、芒硝、赤芍等多味藥材按一定比例組成，由廣東康誠堂醫(yī)藥科技有限公司提供，每克含生藥6.15 g。藥材購自廣州采芝林藥業(yè)連鎖店，均經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院李書淵教授鑒定。本方依據(jù)大承氣湯組方[3]優(yōu)化成清胰湯，后經(jīng)過多年藥物制劑實(shí)驗(yàn)調(diào)制研究開發(fā)成固體顆粒劑型，隨后多年進(jìn)行了動物毒理學(xué)和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，包括清胰顆粒對NF-κB 炎癥通路及氧化應(yīng)激等的作用，結(jié)果證實(shí)清胰顆粒可有效治療SAP，且無明顯毒副作用[4-5]。水通道蛋白4（aquaporin protein 4,AQP4）為分布廣泛并參與水及甘油等小分子轉(zhuǎn)運(yùn)的膜通道蛋白，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。研究顯示AQP4 表達(dá)改變可影響重要器官水代謝平衡，嚴(yán)重影響器官功能[6]。本課題所用清胰顆粒由陳墾教授贈予，本研究擬通過探討AQP4在SAP大鼠腎臟組織中表達(dá)變化對腎功能的影響，從而明確QYG 治療SAP 腎損傷大鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD 大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量250～300 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0002。

1.2 主要試劑和儀器

AQP4多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc-32739）；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（山羊抗兔，批號：bs-80295G-HRP）、β-actin（批號：bsm-33036M）、ECL 發(fā)光試劑盒（批號：C05-07004）和腎損傷因子試劑盒（Kim-1，批號：bsk11070）均購自博奧森公司；通用型SP-9000 試劑盒（北京中山金橋，批號：SP-9000）；白介素-6（IL-6，批號：bsm-10807M）和腫瘤壞死因子（TNF-α，批號：CME0004）ELISA 試劑盒均購自美國eBioscience 公司；牛黃膽酸鈉（美國Sigma 公司，批號：T7515）；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號：11715）；地塞米松（dexamethasone,DXMS，山東新華制藥有限公司，批號：H37020291）；清胰顆粒（廣東藥科大學(xué)自備，規(guī)格：10 mg/包，每克含生藥6.15 g）；HITACHI 全自動生化分析儀（日本日立公司）；Anthos2010 型酶標(biāo)儀（Anthos tabtec instranents 公司）；Image-pro PLUS6.0 顯微圖像系統(tǒng)（Media Cybernetics公司）；切片機(jī)（徠卡RM2135）。

1.3 大鼠SAP腎損傷模型的建立

實(shí)驗(yàn)前SD 大鼠禁食不禁水12 h，以3%（φ）戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉SD大鼠后固定于手術(shù)臺，2%絡(luò)合碘消毒。沿腹正中線開腹提取十二指腸，辨認(rèn)出胰膽管及肝門部膽總管。找到十二指腸乳頭開口，在其開口略偏下對側(cè)系膜緣腸壁上選一無血管區(qū)，用5號注射器針頭戳一小孔，置入預(yù)先備好拉細(xì)的硬膜外導(dǎo)管，向乳頭開口方向逆行探入胰膽管內(nèi)，逆行推進(jìn)4～5 mm 后在胰膽管下段及其內(nèi)導(dǎo)管一并縫扎關(guān)閉肝門部膽總管，以防止導(dǎo)管脫出及牛磺膽酸鈉進(jìn)入十二指腸和肝臟。導(dǎo)管末端接輸液轉(zhuǎn)換器，用微量泵逆行泵入5%STC（0.1 mL/100 g，0.2 mL/min），2～3 min后即可見胰腺充血、水腫、胰膽管及主胰管擴(kuò)張。維持8～10 min后解除結(jié)扎，退出導(dǎo)管。按壓腸壁穿刺孔1～2 min，將腸管復(fù)位，逐層關(guān)腹。假手術(shù)組（SO組）僅翻動十二指腸、胰腺后關(guān)腹。所有大鼠術(shù)后均于大腿外側(cè)皮下補(bǔ)液（生理鹽水2 mL/100 g），蘇醒后禁食不禁水。SAP 并發(fā)腎損傷模型的鑒定：建模24 h 后取大鼠耳靜脈血采用Kim-1 試劑盒檢測血清Kim-1 水平，Kim-1水平≥正常大鼠3倍視為建模成功[4]。

1.4 分組與給藥

SD大鼠64只，隨機(jī)分SO組、SAP組、QYG組和DXMS 組，每組16 只，SAP 組和QYG 組于造模前12 h 每只大鼠分別給予生理鹽水（1 mL/100 mg）和QYG（1 mL/100 mg）灌胃，建模后禁食不禁飲，QYG組大鼠給予QYG 兌水1∶1（w∶w）灌胃（1 mL/100 g）每12 h 1次，DXMS組大鼠給予DXMS肌注（5 mg/kg），每天1次，SO組大鼠不予藥物干預(yù)，分別于48 h和72 h 兩個時間點(diǎn)心臟采血。

1.5 大鼠腎干濕質(zhì)量比及其腎臟系數(shù)

稱大鼠體質(zhì)量后，心臟采血處死取左腎去除被膜，稱其濕質(zhì)量，后放入干燥箱中105 ℃烘干至恒重（2 次干質(zhì)量之差＜0.2 mg），稱其干質(zhì)量，再測干質(zhì)量/濕質(zhì)量；大鼠腎臟系數(shù)=腎臟濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.6 血清AMS、Scr和BUN水平的檢測

大鼠心臟采血2 mL，室溫凝固2 h、低溫低速（4 ℃，3 500 r/min）離心后取其上清液，-20 ℃保存。應(yīng)用HITACHI全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中淀粉酶（AMS）、Scr和BUN不同時間點(diǎn)的變化水平。

1.7 血清IL-6和TNF-α水平的檢測

大鼠全血處理方法同上，按IL-6 和TNF-αElisa試劑盒操作步驟測大鼠血清IL-6 和TNF-α的表達(dá)水平，各指標(biāo)重復(fù)1 次，取均值統(tǒng)計(jì)分析，觀察各組大鼠不同時間點(diǎn)炎癥因子的變化趨勢及其相關(guān)性。

1.8 大鼠腎臟組織病理觀察

取大鼠右腎組織，用10%（φ）甲醛過夜固定、脫水、石蠟包埋，病理切片（厚度為4 μm），HE 染色后，晾干封片，光鏡下按腎臟組織中炎性細(xì)胞浸潤、充血水腫和組織出血及細(xì)胞壞死3個維度各自面積百分比打分（正常：0分，0＜10%：1分，10%～25%：2分，25%～50%：3 分，50%～75%：4 分，＞75%：5 分）對腎臟組織病理進(jìn)行雙盲評分[7]。

1.9 腎臟AQP4蛋白的檢測

1.9.1 免疫組化法定性檢測 取腎臟組織切片，常規(guī)融蠟、脫蠟、脫水，按中山金橋SP-9000 免疫組化試劑盒步驟操作，一抗AQP4（1∶50），DAB試劑盒顯色，晾干、封片，著色細(xì)胞為AQP4 表達(dá)陽性。陰性對照用磷酸鹽緩沖液（PBS）替代一抗。光鏡下按陽性細(xì)胞百分率：＜10%為（-），10%～25%為（+），25%～50%為（++），＞50%為（+++）；染色強(qiáng)度：基本不著色為（-），淡黃色為（+），黃色為（++），棕黃色為（+++），對腎臟組織免疫組化結(jié)果進(jìn)行雙盲評分。

1.9.2 Western blot法定量檢測 取大鼠腎組織150 g，眼科剪剪碎移入勻漿器中，加入655 μL 組織裂解液和38 μL PMFS 混合勻漿，冰上反應(yīng)30 min，4 ℃12 000 r/min 離心10 min 后取上清液，按BCA 蛋白定量試劑盒方法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出樣品蛋白濃度，取50 μg 蛋白為上樣量，6%濃縮膠和10%分離膠電泳分離蛋白質(zhì)，半干膠電轉(zhuǎn)移凝膠蛋白至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF 膜2 h，一抗AQP4（1∶300），室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，二抗（1∶8 000）室溫孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次，按ECL 試劑盒方法發(fā)光，暗盒曝光、顯影、定影，用Image-pro PLUS6.0 顯微圖像系統(tǒng)拍片分析圖像灰度。內(nèi)參β-actin（1∶700）Western blot 步驟同上。以上操作均重復(fù)2次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。組間比較運(yùn)用重復(fù)測量兩因素多水平方差分析，配對資料t檢驗(yàn)和多因素間相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腎臟干濕質(zhì)量比和腎臟系數(shù)

SAP 組大鼠的腎臟干濕質(zhì)量比較SO 組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），QYG 組、DXMS 組腎臟干濕質(zhì)量比與SAP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SAP組大鼠腎臟系數(shù)較SO組增大（P＜0.05），QYG 組、DXMS 組大鼠腎臟系數(shù)與SAP 組比較減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腎臟干濕質(zhì)量比和腎臟系數(shù)比較Table 1 Comparison of kidney dry wet weight ratio and kidney coefficient of rats in each group (，n=16)

表1 各組大鼠腎臟干濕質(zhì)量比和腎臟系數(shù)比較Table 1 Comparison of kidney dry wet weight ratio and kidney coefficient of rats in each group (，n=16)

與SO組比較：*P＜0.05；與SAP組比較：△P＜0.05。

2.2 各組血清AMS、BUN和Scr結(jié)果比較

SAP大鼠血清AMS水平較SO組明顯升高，72 h有所下降，但仍高于SO 組，SAP 組的各指標(biāo)與SO組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2，P＜0.05）。QYG、DXMS 治療組各時間點(diǎn)峰值下降，72 h 下降顯著（P＜0.05）。SAP 大鼠血清BUN 和Scr 含量均高于SO大鼠，經(jīng)QYG和DXMS治療后均有下降，72 h降低明顯，DXMS 組效果優(yōu)于QYG 組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清AMS、BUN和Scr水平比較Table 2 Comparison of serum AMS，BUN and Scr levels in rats of each group(，n=16)

表2 各組大鼠血清AMS、BUN和Scr水平比較Table 2 Comparison of serum AMS，BUN and Scr levels in rats of each group(，n=16)

與SO組比較：*P＜0.05；與DXMS組比較：▲P＜0.05；與SAP組比較：△P＜0.05。

2.3 各組血清IL-6和TNF-α含量比較.

血清IL-6 和TNF-α含量在SO 組大鼠各時間點(diǎn)均變化不大，但在SAP 大鼠中顯著升高，IL-6 水平48 h 達(dá)到峰值，72 h 有所回落，而TNF-α則持續(xù)升高，與SO 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)QYG 和DXMS干預(yù)后兩指標(biāo)均有下降，72 h效果明顯，效果呈現(xiàn)時間依賴性，DXMS 組療效優(yōu)于QYG組，與SAP 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。血清IL-6 與TNF-α水平相關(guān)分析顯示r=-0.032，P=0.952，結(jié)果提示IL-6與TNF-α表達(dá)無明顯相關(guān)性。

表3 各組大鼠血清IL-6和TNF-α變化Table 3 Changes of serum IL-6 and TNF-α in rats of each group(，n=16) ρ（ng·L-1）

表3 各組大鼠血清IL-6和TNF-α變化Table 3 Changes of serum IL-6 and TNF-α in rats of each group(，n=16) ρ（ng·L-1）

與SO組比較：*P＜0.05；與DXMS組比較：▲P＜0.05；與SAP組比較：△P＜0.05。

2.4 腎臟病理結(jié)果

SO組大鼠腎臟無明顯病理損傷，SAP組可見腎臟細(xì)胞充血水腫，炎性細(xì)胞浸潤，甚至出血、壞死，部分腎臟結(jié)構(gòu)模糊，并出現(xiàn)腎小球固縮現(xiàn)象，48 h病理改變明顯；予QYG 和DXMS 治療后SAP 大鼠腎臟的病理損傷減輕，病理評分下降，治療72 h 改善明顯，QYG 組效果略遜于DXMS 組，與SAP 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。SAP 組大鼠腎臟病理評分與其血清IL-6 與TNF-α水平相關(guān)分析呈正相關(guān)性（r=0.675，r=0.583）。

圖1 大鼠72 h腎臟病理HE染色結(jié)果（200×）Figure 1 Pathological HE staining results of rat kidney at 72 h(200×)

2.5 腎臟AQP4蛋白免疫組化結(jié)果

免疫組化顯示AQP4蛋白主要表達(dá)于近端腎小管和腎髓質(zhì)部位，在SO 組2個時間點(diǎn)表達(dá)較少且變化不大，在SAP 大鼠則隨時間推移AQP4 表達(dá)明顯上調(diào)，48 h表達(dá)顯著增多；經(jīng)QYG和MXDS治療后，AQP4 蛋白表達(dá)較同期SAP 組大鼠減少，72 h 下調(diào)明顯（圖2）。

圖2 大鼠72 h腎臟AQP4免疫組化結(jié)果（IHC，40×）Figure 2 Immunohistochemical results of AQP4 in rat kidney at 72 h(IHC,40×)

2.6 腎臟AQP4免疫印跡結(jié)果

免疫印跡顯示AQP4 蛋白在SO 組兩個時間點(diǎn)表達(dá)量較少且相對穩(wěn)定，在SAP組兩個時間點(diǎn)表達(dá)量均明顯增多，與SO 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；經(jīng)QYG 和DXMS 干預(yù)后AQP4 表達(dá)下調(diào)，有時效性，72 h下降顯著，DXMS組療效優(yōu)于QYG 組，但仍高于同期SO 組表達(dá)量（圖3）。相關(guān)分析提示SAP組大鼠腎臟AQP4 蛋白表達(dá)量與血清TNF-α和IL-6水平呈正相關(guān)（r=0.764，r=0.784）。

圖3 各組大鼠腎臟組織AQP4蛋白免疫印跡結(jié)果及免疫印跡評分統(tǒng)計(jì)圖Figure 3 Immunoblotting result of AQP4 protein in kidney tissues of rats in each group

3 討論

AP 為臨床常見多發(fā)急腹癥，約有10%～20%可進(jìn)展為SAP，并發(fā)多器官損害，如肝、肺和腎等，SAP并發(fā)腎損傷的發(fā)生率為45.5%[1]，導(dǎo)致腎損害的機(jī)制目前尚未明確，可能與多因素有關(guān)。腎臟是機(jī)體排泄代謝毒物最重要的器官，SAP 時有效血容量減少、過度炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可直接致腎損傷，重者腎衰竭危及生命。研究顯示TNF-α和氧自由基（0FR）對腎臟有直接毒性作用[8]。前期研究顯示5%STC 誘導(dǎo)大鼠SAP 易并發(fā)肝腎損傷[4]，本研究發(fā)現(xiàn)SAP 大鼠血清AMS、Scr 和BUN 顯著升高，腎臟干濕質(zhì)量比下降，腎臟系數(shù)減小，腎臟病理損傷明顯，提示本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的SAP 腎損傷模型成功。深入分析發(fā)現(xiàn)SAP 大鼠早期血清TNF-α和IL-6 即升高，但相關(guān)分析顯示血清TNF-α和IL-6與腎臟病理損傷評分呈正相關(guān)，提示SAP 大鼠爆發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)參與觸發(fā)SIRS和多器官功能障礙綜合征（MODS）。

TNF-α誘導(dǎo)IL-l、IL-6、內(nèi)皮素-1（ET-1）表達(dá)增多，增加腎血管通透性，使IL-1 和IL-6 滲入組織間隙，ET-1 強(qiáng)烈收縮腎血管，不利于炎癥因子的清除。研究顯示SAP 大鼠腎組織中TNF-αmRNA 表達(dá)明顯升高，提示TNF-α可能在SAP 并發(fā)腎損傷中具有重要作用[7，9]。中藥可改善臟器微循環(huán)，減少ET 分泌入血、增加血流，有利于清除炎癥介質(zhì)，從而改善SAP 引起的腎損傷[3-4，10]。盡早用中藥干預(yù)SAP 可保護(hù)腸道屏障和抑制炎癥反應(yīng)從而減輕SAP 的嚴(yán)重程度[11-12]。清胰湯可明顯降低SAP 患者血中TNF-α、IL-6、IL-8 濃度和提高免疫功能從而顯著改善患者的預(yù)后[12]。DXMS 能有效抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子釋放和改善腎臟血流[13]。本研究發(fā)現(xiàn)SAP大鼠經(jīng)QYG和DXMS治療后，血清AMS、TNF-α、IL-6、Scr和BUN水平有所下降，干預(yù)48 h所有指標(biāo)下降明顯，72 h 更顯著，結(jié)果表明QYG 可有效減輕SAP大鼠的炎癥反應(yīng)和腎損傷，QYG護(hù)腎效果呈時效依賴性，但QYG 組療效稍遜于DXMS 組。綜上，清胰顆粒通過抑制SAP 大鼠的炎癥反應(yīng)可有效保護(hù)其腎功能并改善SAP病情。

AQPs 在全身許多器官均有表達(dá)，腎臟表達(dá)AQPs蛋白可能參與體液成分的急性或慢性調(diào)節(jié)[14]。AQP4是AQPs蛋白家族成員之一，主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合小管上皮基底外側(cè)膜，與AQP3 一起對集合管上皮頂質(zhì)膜AQP2重吸收的水分起擴(kuò)散和滲透作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α信號通過腫瘤壞死因子受體-1（TNFR1）路徑介導(dǎo)上調(diào)AQP4[16]；重組IL-1 可使培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4 表達(dá)增加，但其誘導(dǎo)效應(yīng)呈濃度和時間依賴性，抑制NF-κB 通路可阻斷IL-1 濃度依賴性AQP4 表達(dá)[17]。抑制大腦炎癥反應(yīng)，下調(diào)IL-6水平，可降低AQP4表達(dá)[18]。AQP4 上調(diào)使水分子更易彌散入腎臟組織間隙，加重腎臟水腫和功能損傷。本研究顯示SAP 大鼠血清TNF-α和IL-6 濃度升高與腎臟組織中AQP4 蛋白表達(dá)量均呈正相關(guān)，提示TNF-α和IL-6 可上調(diào)AQP4 表達(dá)。據(jù)報道大黃能抑制胰腺炎大鼠的炎癥反應(yīng)、清除自由基和減少腸道毒素吸收從而減輕器官損傷和改善臨床癥狀[19]，研究顯示大黃可抑制大鼠腎臟AQP2 和AQP4 蛋白及其mRNA 表達(dá)，下調(diào)AQPs 表達(dá)引起多尿、煩渴[20]。本研究顯示SAP大鼠經(jīng)QYG 和DXMS 干預(yù)后血清TNF-α和IL-6 含量下降，腎組織中AQP4 蛋白表達(dá)量減少，血清BUN 和Scr 水平降低，腎臟病理損傷減輕，腎干濕質(zhì)量比升高，證實(shí)QYG 和DXMS 均可有效保護(hù)SAP 腎臟。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SAP 大鼠血清TNF-α和IL-6 水平和腎臟AQP4 表達(dá)量在早期即升高，TNF-α和IL-6 明確參與腎損傷。可見，AQP4 參與SAP 并發(fā)腎損傷病理生理過程。SAP 大鼠經(jīng)QYG和DXMS 干預(yù)后大鼠血清TNF-α、IL-6、BUN 和Scr含量下降，腎臟AQP4表達(dá)量減少，水重吸收和彌散改善，腎臟病理損傷減輕，二者均有保護(hù)腎臟作用。推測QYG 可能通過抑制炎癥因子TNF-α、IL-6 表達(dá)使腎臟AQP4 表達(dá)下調(diào)從而起到保護(hù)腎臟作用，其分子機(jī)制還需進(jìn)一步深入探討。