藤茶提取物及活性成分對創傷弧菌的體外抑菌活性及作用機制

祁子麟，陳詠琪，蔡延渠，3，4，李苑新，3，4，5，魯湘鄂，3，4，張萱萱，3，4

（1.湖北科技學院醫學部，湖北咸寧 437100；2.廣東藥科大學新藥研發中心，廣東廣州 510006；3.國家中醫藥管理局中藥制劑實驗室（三級），廣東廣州 510006；4.廣東省教育廳現代中藥重點實驗室，廣東廣州 510006；5.廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東廣州 510006）

創傷弧菌（Vibrio vulnificus）屬于革蘭陰性菌，是重要的海洋食源性病原菌之一，可引起原發性敗血癥、炎癥介導的感染性休克和壞死性傷口感染如壞死性筋膜炎，病情發展快、死亡率高[1]，目前美國、中國、澳大利亞、德國、韓國和日本等國均有創傷弧菌感染病例的報道。究其原因，與食用被創傷弧菌污染的生海鮮或暴露在含有創傷弧菌的溫暖海水中的開放性傷口有關，即能夠通過傷口、腸道等途徑引起水產動物和人體感染[2-3]。近年來，水產品中的創傷弧菌污染狀況及耐藥情況愈發嚴重[4-5]，其致病性與耐藥性可嚴重威脅到人類的生命健康。因此，迫切需要開發出新的抗菌劑或通過相關技術方法提升現有藥物的抗菌活性。

藤茶，又名顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），是葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄[Ampelopsis megalo‐phylla（Hand.-Mazz）W.T.Wang]的嫩莖葉，為民間藥食兩用品種之一，具有清熱利濕、平肝降壓、活血通絡的功效。其不同部位提取物中均含有豐富的黃酮類成分（如二氫楊梅素、楊梅素、蛇葡萄素等）以及酚類化合物（如沒食子酸等），其中葉中總黃酮含量最高（41.2%～45.3%）[6]，具有抗菌[7]、抗炎[8]、抗氧化[9]、護肝[10]、免疫調節[11]等多種功能作用，但是目前尚無藤茶提取物及其有效成分對創傷弧菌的抗菌活性及作用機制研究報道。因此，本文擬采用KB 紙片法、微量肉湯二倍稀釋法測定藤茶提取物及二氫楊梅素、沒食子酸對創傷弧菌的體外抑殺活性，同時以酶標儀法結合試劑盒法分析抗菌作用機制，為其作為抗菌劑的應用開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）藥材：藤茶葉，采自湖北恩施來鳳，經廣東藥科大學新藥研發中心李苑新副研究員鑒定為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄[Ampelopsis megalophylla（Hand.-Mazz）W.T.Wang]的嫩莖葉。藥品：二氫楊梅素（批號：SXXZ20220403），陜西夏州生物科技有限公司；沒食子酸（批號：C17D10C105977），上海源葉生物科技有限公司。

（2）實驗菌株：創傷弧菌，ATCC27562，來源于廣東省微生物研究所。

1.2 試劑與儀器

（1）主要試劑：2216E 液體培養基、2216E 瓊脂培養基，海博生物技術有限公司；0.5%無菌TTC 溶液，廣東環凱微生物科技有限公司；堿性磷酸酶（AKP）測試盒、BCA 試劑盒，南京建成生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

（2）主要儀器：SW-CJ-1FD 型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；HPP110恒溫培養箱（德國美墨爾特有限公司）；YX-280D 手提式壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫療設備有限公司）；Synergy HTX酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；UV-1700紫外分光光度計（日本島津有限公司）。

1.3 藤茶提取物制備及溶液配制

參考文獻[12]操作。準確稱取100 g 藤茶葉于圓底燒瓶中，按料液比1∶30（體積比）加入水（或70%乙醇），浸泡0.5 h，100 ℃（或80 ℃）加熱回流提取2 次，1.5 h/次，合并2 次提取液，75 ℃減壓濃縮至一定濃度，真空干燥。采用紫外分光光度法，測得藤茶水提物中二氫楊梅素的含量為610.39 mg/g、沒食子酸含量為200.64 mg/g，藤茶70%醇提物（以下簡稱“藤茶醇提物”）中二氫楊梅素的含量為728.96 mg/g、沒食子酸含量為163.77 mg/g。

分別稱取適量的藤茶水提物、藤茶醇提物、二氫楊梅素、沒食子酸，以含2.0%吐溫-80、6.0% DMSO的水溶液為助溶劑配制質量濃度為20 mg/mL的溶液。

1.4 菌懸液制備

將保存的創傷弧菌菌種取出復蘇20 h，挑取單菌落于2216E 液體培養基中，30 ℃振蕩培養8 h，比對計數，稀釋成濃度為2.0×106CFU/mL的菌懸液[13]。

1.5 藤茶提取物的體外抗菌活性測定

1.5.1 抑菌環直徑測定 采用K-B紙片法[13]，分別吸取10 μL 濃度為20 mg/mL 的藤茶水提物溶液、藤茶醇提物溶液、二氫楊梅素溶液、沒食子酸溶液至無菌空白藥敏片上，60 ℃烘干，制備成藥敏片。吸取100 μL 濃度為2.0×106CFU/mL 的菌懸液至2216E 瓊脂板上，涂布均勻，貼放藥敏片，30 ℃培養20 h，用游標卡尺測量抑菌環直徑。評價標準：直徑＞20 mm表示極敏感，15～20 mm 表示高度敏感，10～15 mm表示中度敏感，6～10 mm 表示低度敏感，≤6 mm 表示不敏感。

1.5.2 MIC及MBC測定 采用微量二倍稀釋法[13]，取96 孔細胞培養板，在每排的第1～9 孔中加入100 μL菌懸液，再分別吸取濃度為20 mg/mL的藤茶水提物溶液、藤茶醇提物溶液、二氫楊梅素溶液、沒食子酸溶液100 μL 于細胞培養板橫排第1 孔中，混勻后吸取100 μL 于第2 孔中，依次進行倍比稀釋至第8 孔，使得孔中混合液藥物終質量濃度依次為10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、0.078 mg/mL；第9孔加入100 μL 無菌助溶劑（含2.0%吐溫-80、6.0%DMSO的水溶液）作為空白對照。加樣后，于30 ℃孵育20 h，取出后每孔加入0.5%無菌TTC 溶液進行顯色，以顏色不變紅者為MIC 值。同時選擇藥物濃度為MIC、2 MIC、4 MIC 的對應孔，分別吸取50μL 培養液于2216E 瓊脂板上涂勻，30 ℃培養20 h，取出觀察計數，以無菌生長者為MBC。

1.6 藤茶提取物的抗菌作用機制[13]

1.6.1 對創傷弧菌生長特性的影響（1）藤茶醇提物不同濃度組：分別加入500 μL 的20 mg/mL 藤茶醇提物溶液和2.0×106CFU/mL 的菌懸液于12 孔板中，使混合液終濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC；（2）創傷弧菌空白對照組：只加入同量的無菌助溶劑溶液和菌懸液。于30 ℃振蕩培養12 h，每隔2 h 取出培養液，采用酶標儀測定波長600 nm 處的吸光度（A）值，以t為橫坐標、A600為縱坐標繪制生長抑制曲線，考察不同濃度藤茶醇提物在不同作用時間下對創傷弧菌生長的影響。

1.6.2 對創傷弧菌細胞壁通透性的影響（1）藤茶醇提物不同濃度組：分別加入500 μL 的20 mg/mL藤茶醇提物溶液和2.0×106CFU/mL 的菌懸液于12孔板中，使混合液終濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC；（2）創傷弧菌空白對照組：只加入同量的無菌助溶劑溶液和菌懸液。于30 ℃振蕩培養6 h，將培養液取出，4 000 r/min 低溫離心15 min，取上清液，按照AKP 試劑盒說明書進行操作，于酶標儀中波長520 nm 下測定吸光度（A）值，代入公式計算AKP 活力，分析不同濃度藤茶醇提物在一定作用時間內對創傷弧菌細胞壁通透性的影響。

其中，C標準：酚標準液濃度，0.1 mg/mL；N：樣本測試前稀釋倍數。

1.6.3 對創傷弧菌細胞膜的影響（1）藤茶醇提物不同濃度組：分別加入1 000μL的20 mg/mL藤茶醇提物溶液和2.0×106CFU/mL的菌懸液于12孔板中，使混合液終濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC；（2）空白對照組：只加入同量的無菌助溶劑溶液和菌懸液。于30 ℃振蕩培養6 h，將培養液取出，4 000 r/min 低溫離心15 min，取上清液，①于酶標儀中波長260 nm處測定吸光度值，分析不同濃度藤茶醇提物在一定作用時間內對創傷弧菌細胞內核酸含量的影響。②按照BCA試劑盒說明書進行操作，于酶標儀中波長562 nm 下測定吸光度值，計算可溶性蛋白質濃度，分析不同濃度藤茶醇提物在一定作用時間內對創傷弧菌細胞內可溶性蛋白質含量的影響。

1.7 統計學分析

實驗數據以表示，組間差異采用SPSS19.0軟件進行方差分析及t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 藤茶提取物的抑菌活性評價

表1 結果顯示，藤茶水提物對創傷弧菌的抑菌環直徑為（18.28±0.71）mm，表現出高度敏感性，MIC、MBC 均為5.00 mg/mL。藤茶醇提物的抑菌環直徑為（21.45±0.63）mm，表現出極敏感性，MIC、MBC 均為0.63 mg/mL。二氫楊梅素的抑菌環直徑為（20.16±0.49）mm，表現出極敏感性，MIC、MBC為1.25、2.50 mg/mL。沒食子酸的抑菌環直徑為（19.59±0.67）mm，表現出高度敏感性，MIC、MBC為2.50、5.00 mg/mL。幾者相比，藤茶70%醇提物對創傷弧菌的體外抑菌活性最強。

表1 藤茶提取物對創傷弧菌的體外抑菌活性Table 1 In vitro antibacterial activity of Ampelopsis grossed‐entata extracts against Vibrio vulnificus(n=3)

2.2 藤茶醇提物的抗菌作用機制

2.2.1 對創傷弧菌的生長抑制影響 分析圖1 不同作用時間下的A600值可知，創傷弧菌在正常培養0～12 h 內的A600值不斷提高，而不同濃度藤茶醇提物組的變化如下：①1/2 MIC 組與創傷弧菌組的生長趨勢類似，但菌體生長數量稍有減少；②MIC 組的A600值在6～12 h 基本一致，表示菌體生長受到顯著性的抑制影響；③2 MIC 組則在12 h 內A600值基本不變，完全抑制菌體生長。結果表明，藤茶醇提物在1/2 MIC 濃度時，略微影響創傷弧菌的正常生長，而在MIC、2 MIC 時能夠顯著地抑制菌體生長（P＜0.01），表明其抑菌能力隨藥物濃度的提高而增強。

圖1 不同濃度藤茶醇提物對創傷弧菌生長繁殖的影響Figure 1 Effect of different concentrations of Ampelopsis grossedentata extracts on the growth and reproduction of Vibrio vulnificus（n=3）

2.2.2 對創傷弧菌細胞壁通透性的影響 分析圖2可知，創傷弧菌在正常生長6 h后，由于受到細胞壁的保護，其胞外的AKP含量依然保持在低水平；當藤茶醇提物濃度為1/2 MIC時，胞外的AKP含量稍有增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）；而當藥物濃度提高至MIC、2 MIC 時，菌體細胞壁受到明顯破壞，引起胞內AKP外泄，因此導致胞外AKP含量顯著性提高（P＜0.01）。結果表明，藤茶醇提物能夠有效破壞創傷弧菌細胞壁的完整性，且濃度越高，破壞能力越強。

圖2 不同濃度藤茶醇提物對創傷弧菌胞外AKP含量的影響Figure 2 Effect of different concentrations of Ampelopsis grossedentata extracts on extracellular AKP content of Vibrio vulnificus（n=3）

2.2.3 對創傷弧菌細胞膜的影響 分析圖3-4 可知，創傷弧菌在正常生長6 h 后，由于受到細胞膜的保護，胞內核酸（RNA/DNA）、可溶性蛋白質等內容物的外排量很少。當藤茶醇提物濃度為1/2 MIC時，可能對個別菌體的細胞膜具有一定作用，因此內容物略有外泄，但與空白組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；而隨著藥物濃度增加至MIC、2 MIC時，菌體細胞膜受破壞明顯，胞內物質大量外泄，使得胞外核酸、可溶性蛋白質的含量顯著地提高（P＜0.01）。結果表明，藤茶醇提物具有破壞創傷弧菌細胞膜完整性的作用，并且作用強弱隨著藥物濃度的增加而增強。

圖3 不同濃度藤茶醇提物對創傷弧菌胞外核酸含量的影響Figure 3 Effect of different concentrations of Ampelopsis grossedentata extracts on extracellular nucleic acid content of Vibrio vulnificus（n=3）

圖4 不同濃度藤茶醇提物對創傷弧菌胞外可溶性蛋白質含量的影響Figure 4 Effect of different concentrations of Ampelopsis grossedentata extracts on extracellular soluble protein content of Vibrio vulnificus（n=3）

3 討論

研究表明，藤茶中的黃酮類化合物（如二氫楊梅素、藤茶素、藤茶苷、槲皮素、山柰酚）、酚類化合物（如沒食子酸、兒茶素、表兒茶素等）是主要抗菌活性成分[14]，且以二氫楊梅素為代表，可對金黃色葡萄球菌、MRSA、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、糞腸球菌、陰溝腸桿菌、白色念珠菌、雞沙門氏桿菌、豬鏈球菌、根霉、黑曲霉等多種人、畜、植物致病菌具有廣譜高效的抑菌作用（MIC：0.31～10.00 mg/mL）[15]。與中草藥（芒果葉等）[16]、化學抗菌藥（頭孢吡肟、頭孢唑林、亞胺培南、司他丁鈉、苯唑西林、頭孢西丁）[17]聯用，可通過破壞細菌細胞壁及細胞膜的完整性[18]，或干擾微生物糖代謝中的呼吸代謝途徑[19]，或影響蛋白質及遺傳物質[20]（DNA、RNA）等方面起到相加或協同增效作用。

本研究發現，藤茶不同溶劑（水、70%乙醇）提取物及有效成分均能夠抑制食源性創傷弧菌的生長，體外抗菌性能強弱依次為：藤茶醇提物＞二氫楊梅素＞沒食子酸＞藤茶水提物（MIC 依次為：0.63、1.25、2.50、5.00 mg/mL，MBC 依次為：0.63、2.50、5.00、5.00 mg/mL）；通過比較發現，藤茶醇提物較水提物的抗菌活性更強，主要是二氫楊梅素、沒食子酸、槲皮素、兒茶素等活性成分在醇-水體系中更容易溶出，因此含量更高、抗菌活性更強；比活性成分二氫楊梅素、沒食子酸的抗菌活性更強，雖然70%乙醇提取物中只含有72.9%二氫楊梅素、16.4%沒食子酸，但卻也含有其他黃酮類、多酚類的抗菌活性成分，因此不同成分間可能以某種方式起到相互協同或相加作用，從而使其表現出更優的整體抗菌性能。在抗菌作用機制研究中發現，藤茶醇提物達到MIC、2 MIC 時，能夠顯著地抑制菌體正常生長；且在作用6 h 后，能夠顯著破壞創傷弧菌的細胞壁與細胞膜結構和功能的完整性，促使細胞內AKP、核酸、蛋白質等內容物的釋放和干擾菌體細胞內酶系統及遺傳物質的正常代謝，引起膜功能障礙，并誘導細胞死亡，從而有效抑制細菌生長。在下一步的工作中，將對藤茶提取物中不同成分的配伍比例與抗菌活性間的內在關系進行深入探討。

藤茶在廣西、貴州、湖北、湖南、重慶、江西、福建、廣東等多個省市均有種植或野生資源分布，年產量可達萬噸以上[21]，同時目前文獻中尚無藤茶及其活性成分對致病菌產生耐藥性的報道，有望深入開發為天然抗菌劑或抗菌增效劑。