柴胡皂苷A治療高脂血癥作用分子機制的生物信息學分析

程玉鵬，李忠蒙，劉廣杰，高寧，2

（1.黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學中西醫結合博士后科研流動站，黑龍江哈爾濱 150040）

柴胡為我國傳統中藥，具有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣的功效[1]。現代藥理學研究表明，柴胡具有解熱、抗感染、保肝護肝、抗抑郁、降血脂等功能[2-3]。由于柴胡對高脂血癥具有較好療效，因此以柴胡為主要組成的中藥降脂方劑越來越受到關注，如大柴胡湯、柴胡加龍骨牡蠣湯、柴胡疏肝散等均在臨床上得到了廣泛應用[4-5]。然而，目前關于柴胡降脂的研究主要集中于藥效的確證，而其主要有效成分并不清晰、作用靶點尚不明確、作用機制研究較少，也使得相關藥物的質量標準難以確定，影響了柴胡及其類方的進一步開發與應用[5]。課題組對現有研究結果[5-7]分析推定，柴胡中的皂苷類成分柴胡皂苷A 極有可能是柴胡治療高脂血癥的關鍵藥效分子。柴胡皂苷A（saikosaponin A）是五環三萜類齊墩果烷型衍生物，是柴胡藥材質量的指標成分之一。現有研究表明，柴胡皂苷A 對于腫瘤、炎癥性疾病、癲癇、肝損傷等均表現出較好的治療效果[8]，亦有部分研究顯示，柴胡皂苷A 能夠影響細胞對脂類分子的吸收與轉運[7]，可能是柴胡降血脂的活性成分之一。為深入探討柴胡皂苷A 的降血脂作用及其可能的分子機制，本研究采用生物信息學手段，建立“藥效分子-靶點-信號通路-疾病”的關聯性并利用qPCR 對分析結果進行驗證，以期為開發柴胡皂苷A 新的治療應用奠定理論基礎，也為揭示柴胡及其類方治療高脂血癥的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及細胞株

人體肝癌細胞（HepG2）由中科院細胞庫提供，由本實驗室繼代保存。

SV Total RNA Isolation System，GoScriptTMReverse Tanscription System，GoTaq?qPCR Master Mix 均購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；DMEM培養基購自賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司；胎牛血清購自賽澳美細胞技術（北京）有限公司；總膽固醇（TC/TCH）測定試劑盒，甘油三脂（TG）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司；柴胡皂苷A 購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 靶點預測

在PubChem 中搜索柴胡皂苷A（saikosaponin A）的結構信息，下載得到其簡化分子線性輸入規范（Simplified molecular input line entry specification，SMILES）文件，將SMILES 信息導入小分子靶點在線預測分析系統SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/index.php），SwissTargetPre‐diction 可基于“相似性原理（similarity principle）”對柴胡皂苷A 與其數據庫中超過370 000 個活性靶點進行匹配，進而分析預測其可能的靶蛋白。

1.3 靶點蛋白生物學功能及信號通路富集分析

將分析得到的靶點導入基因本體論數據庫（gene oncology，GO）得到靶點蛋白參與的生物過程（biological process），同時將靶點信息導入京都基因與基因組百科全書數據庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG），得到各靶點所參與的信號通路及代謝通路，全面了解靶點蛋白的生物學功能。隨后，利用STRING 11（http：//string-db.org）富集分析功能對靶蛋白的生物學過程及信號通路進行富集分析，篩選得到柴胡皂苷A 顯著調節的生物功能，探討其對高脂血癥的影響。

1.4 靶點蛋白相互作用網絡分析

將分析得到的靶點列表導入STRING 11，得到蛋白質間相互作用關系，構建蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction networks，PPI networks），隨后導入Cytoscape 軟件，利用復合分子檢測法（MCODE）分析PPI 網絡，篩選相互作用關系模塊（Module），明確各模塊生物學功能，探討柴胡皂苷A治療高脂血癥的分子機制。

1.5 HepG2細胞中TC、TG含量的測定

取處于對數生長期的HepG2 細胞，胰酶消化后用PBS 調整細胞濃度為1×106個/mL，接種于六孔板，每孔2 mL，5% CO2、37 ℃培養24 h，棄上清。將細胞隨機分為藥物處理組與對照組，藥物處理組每孔加入2 mL 含有10 μg/mL 柴胡皂苷A 的無血清培養基，對照組加入2 mL 無血清培養基，37 ℃孵育24 h，每組設6 個復孔。隨后棄上清，PBS 清洗2 次，加入含30%胎牛血清的DMEM 培養基孵育24 h。孵育結束后，按照試劑盒說明書操作，檢測各組HepG2細胞中總膽固醇（TC）及甘油三酯（TG）含量。

1.6 實時定量PCR驗證關鍵靶點基因表達變化

1.6.1 樣品處理

取處于對數生長期的HepG2 細胞，胰酶消化后用PBS 調整細胞濃度為1×106個/mL，接種于六孔板，每孔2 mL，5%CO2、37 ℃培養24 h，棄上清。將細胞隨機分為藥物處理組與對照組，藥物處理組每孔加入2 mL 含有10 μg/mL 柴胡皂苷A 的無血清培養基，對照組加入2 mL 無血清培養基，37 ℃孵育24 h。每組設6 個復孔。孵育結束后，用PBS 清洗細 胞2 次，按照SV Total RNA Isolation System 總RNA 提取試劑盒說明書操作，提取細胞總RNA，經電泳及NanoDrop 8000 檢測合格后（電泳條帶清晰，A260/A280 在1.9～2.2 之間），通過逆轉錄試劑盒GoScriptTMReverse Tanscription System 合成cDNA。-80 ℃保存備用。

1.6.2 qPCR驗證基因表達

取cDNA 樣本，利用GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒，按如下參數進行qPCR。預變性階段：95 ℃，2 min；循環階段：95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸1min，40個循環；熔解曲線階段：65 ℃→95 ℃，臺階時間15 s，臺階溫度1 ℃。

以GAPDH為內參，利用2-△△Ct比較靶點基因在給藥組與對照組間表達差異（n=6）。所用引物經Primer Premier 6.0設計并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primers of target genes

2 結果

2.1 柴胡皂苷A靶點信息

將柴胡皂苷A 的結構信息輸入SwissTargetPre‐diction 后，共篩選得到100 個靶點蛋白結果，對其中打分前50 位的靶點蛋白進行統計分析表明，G 蛋白偶聯受體家族A（20%）、激酶（16%）、磷酸酶（10%）以及蛋白酶（10%）是所占比例最多的類別，見圖1。而在預測打分中排名最前的10 個靶點蛋白依次為細胞信號轉導與轉錄激活因子3（STAT3）、白細胞介素-2（IL-2）、蛋白酪氨酸磷酸酶1b（PTPN1）、血小板活化因子受體（PTAFR）、腎素（REN）、己糖激酶4型（GCK）、白三烯B4受體1（LTB4R）、T細胞蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPN2）、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶α（PTPRA）、酰胺A1 受體（ADORA1）。預測打分中，可能性排名前20的靶點蛋白見表2。

表2 柴胡皂苷A作用可能性排名前20的靶點蛋白Table 2 The top 20 proteins for the possibility of targeting by saikosaponin A

圖1 靶點蛋白各類別比例Figure 1 Piechart of target proteins categories

2.2 靶點蛋白生物學功能與信號通路富集分析結果

利用GO對得分前50名的靶點蛋白進行生物學功能注釋并對其進行富集分析，結果表明，柴胡皂苷A 靶點蛋白主要涉及信號轉導（GO：0023056，GO：1902533）、磷酸化（GO：0042325）、細胞增殖調控（GO：0042127）、對刺激的應答（GO：0009605）等多種生物學過程，其中富集顯著性排名前10位的生物學過程如圖2所示。對柴胡皂苷A 靶點蛋白參與的通路進行富集分析結果表明，靶點蛋白主要參與的信號通路包括PI3K-Akt 信號通路（hsa04151）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（hsa01521）、神經活性配體-受體相互作用（hsa04080）、Jak-STAT 信號通路（hsa04630）、鞘磷脂信號通路（hsa04071）等，其中富集顯著性排名前10位的代謝及信號通路見表3。

表3 柴胡皂苷A靶點蛋白富集顯著性前10位的代謝及信號通路Table 3 Top 10 KEGG pathways of target proteins effected by saikosaponin A

圖2 柴胡皂苷A靶點蛋白富集顯著性前10位的生物學過程Figure 2 Top 10 biological processes of target proteins effected by saikosaponin A

2.3 靶點蛋白相互作用的PPI網絡分析結果

STRING 11 收集整理了超過5 000 個物種的近百萬對蛋白質相互作用關系，通過STRING 11 構建柴胡皂苷A 靶點蛋白互作網絡PPI，見圖3。將PPI網絡關系導入Cytoscape 3.7，利用network analysis分析表明，連通度排在前5 位的蛋白分別為VEGFA、EGFR、GRB2、STAT3、PIK3CA，由MCODE分析得到3 個蛋白相互作用模塊，見圖4，基于GO、KEGG、REACTOME等對各模塊生物學功能進行總結，結果見表4。

表4 模塊相關生物學功能Table 4 Biological functions of the modules

圖3 柴胡皂苷A靶點蛋白相互作用網絡Figure 3 PPI network of target proteins effected by saikosaponin A

圖4 柴胡皂苷A靶點相互作用模塊Figure 4 Modules in the PPI network

2.4 柴胡皂苷A 處理后HepG2 細胞內TC 與TG 含量變化結果

以HepG2 細胞作為模型，檢驗柴胡皂苷A 對細胞內脂質含量的影響。結果表明，柴胡皂苷處理后，HepG2 細胞中總膽固醇及甘油三酯的含量均有所下降（P＜0.05），見圖5，提示柴胡皂苷A 能夠抑制HepG2細胞的脂質代謝及吸收。

圖5 HepG2細胞中TC與TG的含量Figure 5 The contents of TC and TG in HepG2 cells（n=6）

2.5 靶點基因表達差異分析結果

選取了JAK-STAT 信號通路中的關鍵基因STAT3、GRB2、EGFR、SOCS1以及PI3K-Akt 信號通路中的PIK3CA、GRB2、EGFR基因對生物信息分析結果進行驗證。qPCR 結果顯示，柴胡皂苷A 能夠促進HepG2細胞中STAT3、GRB2、PIK3CA、EGFR的表達，并抑制SOCS1基因表達，見圖6。

圖6 目的基因qPCR 的相對表達值Figure 6 Relative expressionvalues of target gene qPCR(n=6)

3 討論與結論

高脂血癥是以血清膽固醇及甘油三酯水平升高為主要特征的病變狀態，是動脈粥樣硬化等多種心血管類疾病的重要誘因，其發病率高、危害大，嚴重威脅著人們的身體健康[9]。近年來，生活水平的不斷提高，以及不健康的飲食及生活習慣等，使得我國高脂血癥患者數量逐年攀升，有效防治高脂血癥也成為現代醫藥研究的重要方向之一。現階段對于高脂血癥的治療仍以藥物干預為主，主要包括他汀類、貝特類、膽固醇吸收抑制劑等多種類型，但各化學合成類降脂藥物均存在較多的不良反應[10]，因此，在實踐中療效確切的中藥及方劑，成為篩選新的高效低毒的降血脂藥物首選來源[9]。作為我國常用的傳統中藥，柴胡及大柴胡湯、小柴胡湯、柴胡疏肝散等方劑均能夠顯著調節高脂血癥患者的脂代謝紊亂，恢復血脂水平，展現出良好的臨床應用效果[6]。其中柴胡所含的柴胡皂苷A在體外實驗中展現出對膽固醇代謝的調節作用[7]，可能是柴胡及其類方降血脂的重要有效成分之一，有望開發成為新的降血脂藥物以及相關方藥質量標準的重要參考指標。

本研究基于生物信息學技術對柴胡皂苷A 潛在靶點及其涉及的生物學過程、信號與代謝通路、蛋白相互作用網絡進行了分析，并基于脂代謝異常與肝癌的密切關系[11]，選擇人肝癌細胞HepG2 作為體外檢測模型，對分析結果進行驗證。結果發現柴胡皂苷A 能夠影響高脂血癥多個相關的基因及信號通路。

信號轉導與轉錄激活因子（signal transducer and activators of transcription,STAT）是最為保守且高效的蛋白轉錄因子家族之一，目前共發現7 個成員（STAT1、2、3、4、5a、5b 和6）。由其介導的JAKSTAT 信號通路是少數幾種多效性級聯轉導通路之一，也是哺乳動物中多種細胞因子與生長因子的主要信號傳遞機制。細胞因子/生長因子與細胞表面受體結合后，引起受體構象改變并激活受體相關的Janus 激酶（receptor-associated Janus kinase,JAK），隨后JAK 互磷酸化并催化受體胞內部分酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的受體通過SH2 結構域與STAT結合，JAK 則通過磷酸化作用激活STAT，活化后的STAT 形成二聚體并轉移至細胞核，進入細胞核的STAT能夠與特異性DNA原件相結合進而調控上千種基因的轉錄。整個信號轉導受多水平調控，其中細胞因子信號抑制蛋白（SCOCS）與蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）是2類比較重要的STAT負調控因素[12]。研究證明，在漢族人群中，STAT3的常見變異與高甘油三酯血癥及肥胖的患病風險有密切關系[13]。JAK2/STAT3 信號通路能夠被瘦素受體激活，在脂代謝過程中發揮重要作用，JAK2/STAT3 信號通路異常能夠導致高脂血癥、動脈粥樣硬化、脂肪肝等多種疾病[12]。許多中藥及方劑也通過調節STAT3實現降脂功能[14-15]。對柴胡皂苷A 潛在靶點進行生物信息學分析發現，得分最高的靶點蛋白為STAT3，表明柴胡皂苷A 對其作用最為明顯，通路分析則發現JAK-STAT 信號通路得到顯著性富集，蛋白相互作用網絡分析也表明STAT3 在柴胡皂苷A 藥理作用網絡中處于重要的節點位置，網絡作用模塊1 的關鍵功能即為JAK-STAT 信號通路。此外，qPCR 也證實通路中STAT3、GRB2、EGFR基因在柴胡皂苷A 的作用下，表達量呈上升狀態；而其抑制基因SOCS1的表達則呈下降狀態。綜上可知，以STAT3 為核心作用靶點，進而調節JAK-STAT 信號通路、改善機體脂質代謝可能是柴胡皂苷A 治療高脂血癥的主要分子機制，見圖7。

圖7 柴胡皂苷A調節JAK-STAT信號通路的靶點Figure 7 Targets of saikosaponin A in JAK-STAT signaling pathway

另一條富集顯著性較高的通路是磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway），在蛋白相互作用網絡連通度前5 位的靶點蛋白中的PIK3CA、EGFR、GRB2 均屬于此通路。PI3K-Akt 信號途徑對多種細胞刺激及毒性刺激均能產生應答，調控轉錄、翻譯、增殖等生理功能。生長因子與受體型磷酸激酶或G 蛋白偶聯受體相結合，分別激活Ia 型與Ib 型PI3K，活化后的PI3K 催化PIP2 生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），后者作為胞內第二信使協助PDK 與mTORC2 催化激活AKT，隨后AKT通過磷酸化作用進一步激活下游蛋白進而調節細胞細胞凋亡、蛋白合成、細胞周期、細胞增殖等生物學過程[16]。qPCR 結果也表明PIK3CA、GRB2、EGFR基因在柴胡皂苷A 的作用表達量呈現上調狀態，客觀反映出柴胡皂苷A 能夠激活PI3K-Akt信號通路。研究顯示，PI3K-Akt信號通路能夠參與高脂血癥[17]、非酒精性脂肪肝[17]、代謝綜合征[18]等疾病的發生發展過程，青錢柳[19]、吳茱萸[20]等中藥的降脂作用也與PI3K-Akt 信號通路密切相關。由此可知，PI3K-Akt 信號通路在柴胡皂苷A 降血脂過程中也發揮了重要作用，見圖8。

圖8 柴胡皂苷A調節PI3K-Akt信號通路的靶點Figure 8 Targets of saikosaponin A in PI3K-Akt signaling pathway

此外，生物信息分析結果表明，靶點蛋白相互作用網絡的關鍵節點蛋白血管內皮生長因子（VEGFA）與高脂血癥引起的血管內皮損傷密切相關[21]；而Ca2+信號、鞘磷脂信號以及溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）異常也被證明與高脂血癥及其并發癥存在關聯[22-24]。

其他顯著性富集通路及其關鍵蛋白如神經活性配體-受體相互作用（hsa04080）、癌癥相關通路（hsa05200）、破骨細胞分化（hsa04380）、白細胞介素-2（IL-2）等則涉及柴胡皂苷A 的抗癲癇、抗腫瘤、抗感染、抑制破骨細胞分化等作用，并已有較多相關研究報道[1，25]。其結果也間接證明了基于生物信息學分析柴胡皂苷A藥效作用分子機理的可行性。

綜上可知，柴胡皂苷A 能夠以STAT3、PIK3CA、VEGFA等為其主要調節位點，通過影響JAK-STAT信號通路、PI3K-Akt 信號通路，輔以鈣離子信號通路、溶血磷脂與LPA 受體、鞘磷脂信號通路等，最終發揮改善機體脂質代謝、治療高脂血癥的作用。

中藥及其方劑具有多成分、多靶點的特征，各味藥君臣佐使亦有其各自功能。因此，以方藥所含全部成分進行網絡藥理學研究，往往會得到各成分及其靶點極為復雜的相互作用關系。對于前期研究較充分的方藥，能夠對照已有結果很快發現新的突破點；而對于前期研究基礎薄弱的方藥，在眾多調節途徑中抽絲剝繭尋找核心機制則顯得力不從心。因此，為聚焦核心機制，本研究以降脂方劑中君藥柴胡的關鍵藥效分子柴胡皂苷A 為研究對象，分析其治療高脂血癥的分子機理，為柴胡皂苷A 的新藥開發奠定基礎，也為進一步分析柴胡及其類方配伍機制提供理論依據，同時為將柴胡皂苷A 納入柴胡降脂類方藥質量標準提供參考。