外泌體miRNAs
——運動促進心血管健康的新靶點

馬春蓮，柳 華，熊曉玲，楊 翼

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）致死、致殘率較高。美國心臟協會（Amer?ican Heart Association， AHA）統計顯示，2015—2018年全球≥20歲的成年人患CVD的幾率達49.2%，2019年一年內全球因CVD死亡的人數約87.5萬（American Heart Associa?tion，2022）。《中國心血管健康與疾病報告2020》顯示，我國各類CVD患者達3.3億，因CVD死亡的人數占全國死亡人數的43%以上，CVD依然是我國居民的首要死因（國家心血管病中心，2021）。盡管心血管研究和臨床護理的進步提高了CVD患者的生存率，但鑒于持續較高的死亡率，仍需要良好的預防、治療策略。運動可以為身體多個系統帶來益處，降低CVD和2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）35%～55%的發病風險（American Association of Diabetes Educators，2012），已經成為預防及緩解CVD的有效措施之一。

外泌體（exosomes，EXO）是由不同類型細胞分泌的直徑在40～150 nm的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），可將其包裹的 microRNAs（miRNAs）、蛋白質、脂質等物質傳遞到受體細胞（Pluchino et al.，2019），在細胞之間、細胞與組織之間發揮重要的信息傳遞作用，參與多種生理和病理過程。EXO具有內分泌、旁分泌和自分泌的特性，不同細胞來源及細胞微環境會影響EXO的分泌及功能（Kalluri et al.，2020）。運動作為機體強烈的刺激可調控EXO的分泌及其內含物，體內75%的運動因子存在于EXO中（Safdar et al.，2016）。

miRNAs是一種長度為22～25個核苷酸，通過與mRNA的3’端結合，在轉錄后調控基因表達的非編碼單鏈RNA（Henning，2021）。miRNAs通過降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，在生物發育、代謝調節、腫瘤發生發展等方面發揮重要調控作用。單個miRNA可以靶向數百個mRNA，而單個mRNA也可以被多個不同miRNAs靶向（Romao et al.，2014），體現出miRNA強大、復雜和靈活的調控潛力。哺乳動物超過60%的蛋白編碼基因直接被miRNAs調控（Friedman et al.，2009）。exomiRs是EXO中重要的內含物，由于受脂質雙層的保護，免于RNA酶分解（Shelke et al.，2014），從而能更有效地調控細胞轉錄后過程。

研究表明，EXO尤其EXO內含的miRNAs（exomiRs）參與了心血管健康的調控。運動促進心血管健康或許是EXO作為細胞間通訊媒介，介導運動產生了多系統效應。基于此，本研究對exomiRs介導運動在促進心血管健康方面的作用進行綜述。

1 exomiRs的來源及去路

exomiRs的形成是復雜而精密的調控過程。細胞核內miRNA基因在RNA聚合酶的作用下生成前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA出核后在細胞漿內經過進一步加工，形成成熟的miRNA（Michlewski et al.，2019）。EXO在生成過程中對細胞漿內成熟的miRNAs進行分選及包裹。細胞膜的內陷形成早期內體（early sorting endosome，ESE），ESE的膜內陷選擇性地包裹細胞漿內的miRNAs、脂質、蛋白質等物質（Henning，2021），形成含有腔內小泡（intraluminal vesicles，ILVs）的晚期內體（late sorting endosome，LSE），隨著ILVs的逐漸積累，LSE形成多泡體（multivesic?ular bodies，MVBs）。溶酶體調控MVBs的降解及EXO的釋放。MVBs生成后可以與溶酶體融合，被降解供細胞循環利用，也可以與細胞膜融合將ILVs釋放到細胞外，即為含特定miRNAs的EXO（Kalluri et al.，2020）。EXO被釋放后可以通過受體細胞內吞、受體-配體介導的胞吐、與受體細胞膜融合3種形式將exomiRs釋放到受體細胞（Wang et al，2019）。進入受體細胞的exomiRs與mRNA靶基因結合（Achkar et al.，2016），從而調控靶基因的降解或抑制其翻譯過程（圖1）。

圖1 exomiRs的來源及去路示意圖Figure 1. Schematic Diagram of the Source and Destination of exomiRs

2 運動對EXO分泌及exomiRs表達的調控

2.1 一次性運動對EXO分泌及exomiRs表達的調控

Fruhbeis等（2015）對12名運動愛好者（每周運動超過3 h）進行研究發現，在一次性遞增強度自行車運動至力竭（起始負荷50 W，每3 min增加50 W）過程中，運動強度達到個體乳酸閾強度前EXO的分泌就已經開始了。運動后即刻循環EXO的水平顯著高于運動前，并在運動結束90 min后恢復到靜息水平。男性大學生進行遞增強度的自行車運動至力竭（起始負荷60 W，每1 min增加30 W），運動后即刻血漿中血小板和中性粒細胞來源的EVs顯著升高，運動后2 h血漿中EVs的水平仍顯著高于靜息狀態（Chaar et al.，2011）。Sossdorf等（2011）對 16名健康男性（根據運動水平分為訓練組與久坐組）進行最大攝氧量和個體乳酸閾水平的測試發現，兩組受試者分別以80%個體無氧閾強度進行90 min自行車運動后血小板、單核細胞、內皮細胞（endothelial cells，ECs）來源的EVs數量顯著增加，但訓練組血漿EVs峰值出現在運動后45 min，久坐組則出現在運動后2 h。有研究發現，運動員進行遞增強度自行車運動至力竭（起始負荷40 W，每3 min增加40 W），運動后即刻ECs、血小板、各種類型白細胞來源的EVs顯著增加（Brahmer et al.， 2019）。以上研究結果顯示，一次性運動能促進EXO的分泌，并且不同運動水平的受試者體內EXO產生與清除的代謝動力學不同。一次性運動促進心血管細胞來源EXO的分泌，由于EXO具有母細胞的某些特性，提示，運動誘導的心血管細胞來源EXO水平的變化可能與運動改善心血管功能、免疫調節、炎癥有關。

exomiRs是EXO參與機體生理和病理過程調控的重要內含物。近年研究發現，運動參與了exomiRs生成過程的調控，并促進了特定exomiRs的表達。Whitham等（2018）研究發現，1 h自行車運動（30 min 55%O2max強度，20 min 70%O2max強度 ，10 min 80%O2max強度）可以促進包括EXO和ILVs結構蛋白在內的超過300種蛋白質表達增加，并且促進EVs向肝臟轉移蛋白質。一次性有氧＋抗阻運動（雙腿以55%O2max強度進行45 min自行車運動＋3組55% 1RM強度的單腿8～12次的伸膝運動，組間間歇2 min）上調了健康男性股外側肌MVBs合成相關蛋白Clathrin和Alix的mRNA表達，同時促進了miRNA加工相關蛋白Dicer和Exportin 5的mRNA表達，并且運動誘導的MVBs合成相關蛋白基因表達量與miRNA加工相關蛋白基因表達量呈正相關（Garner et al.，2020）。提示，一次性運動促進了與EXO生成相關蛋白質的合成。

雖然，還沒有直接證據證明一次性運動促進miRNAs分選并包裹進EXO，至少說明在運動中EXO和miRNAs的生物合成途徑遵循著類似的時間軸，提示一次性運動可能促進miRNAs分選并包裹進EXO的動態過程。Lovett等（2018）發現，倍增跳躍聯合下山跑的訓練（10組10次90%最大跳躍高度，組間間隔1 min，跳躍完成5 min后以10 km/h的速度進行5組4 min的下山跑，坡度為10%，組間間隔2 min），可以選擇性地改變健康男性循環EVs中的miR?NAs，而這些EVs中表達改變的miRNAs參與了骨骼肌損傷后的內源性修復。D’Souza等（2018）發現，一次性高強度間歇運動（10組60 s最大輸出功率的自行車運動，組間間歇75 s）使血漿EXO內含miR-126-3p、miR-23a-3p、miR-208a-3p等9種exomiRs表達顯著上調，并且發生變化的exomiRs與運動誘導的骨骼肌及血漿中發生變化的miR?NAs并不完全一致，提示，運動調控了EXO生成過程中miRNAs的分選，選擇性地促進特定exomiRs的表達。

2.2 長期運動對EXO分泌及exomiRs表達的調控

長期規律性運動可以提高人體免疫力，緩解代謝綜合征，提高生活質量（孫海波 等，2020）。長期運動是否能影響EXO分泌及exomiRs表達備受學者關注。Bertoldi等（2018）研究發現，相比于3月齡大鼠，21月齡及26月齡老年大鼠EXO特異性標志蛋白CD63的表達顯著降低，2周中等強度的跑臺運動（60%O2max，每天20 min）顯著上調了老年大鼠循環EXO中CD63的蛋白表達，下調了循環EXO內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。Wang等（2020）研究發現，4周中等強度的跑臺運動（10 m/min）可增強小鼠循環內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）來源EXO的分泌，上調EPCs來源exomiR-126的表達水平，減少中動脈阻塞誘導的細胞損傷。前期研究發現，db/db糖尿病小鼠進行4周跑臺運動（低強度5 m/min，中等強度10 m/min，每天60 min，每周5天）可強度依賴性地促進EPCs來源EXO的分泌，上調exomiR-126的表達水平（Ma et al.，2018）。此外，8周中等強度的有氧運動（7 m/min，每天300 m，每周5天）促進了db/db糖尿病小鼠心源性EXO中exomiR-455、exomiR-29b、exomiR-323-5p和exomiR-466的表達（Chaturvedi et al.，2015）。

相比于久坐者，周期性運動的老年人基礎狀態下血清exomiR-486-5p、exomiR-215-5p、exomiR-941的水平顯著上調，兩組受試者一次性運動后血清exomiRs的表達譜也不相同，周期性運動者血清中產生變化的exomiRs主要與代謝激活的信號轉導有關（Nair et al.，2020），提示，長期運動通過調控循環exomiRs的表達譜調節老年人的代謝能力。Hou等（2019）對經過1年以上團體賽艇訓練（每天1～2 h，每周6天）的運動員和未訓練者進行研究發現，在最后一次運動24 h后血漿EXO大小、濃度未見顯著差異。值得注意的是，長期運動者血漿EXO對心肌細胞有保護作用，而未訓練者EXO則無此效應，EXO對心肌細胞的保護作用通過 exomiR-342-5p實現（Hou et al.，2019）。以上研究提示，長期規律性運動或許并不能改變基礎狀態下循環EXO的大小及濃度，但可以選擇性地促進體內某些特定細胞來源EXO的分泌。更重要的是，長期運動能調控exomiRs的表達譜，運動通過調控特定exomiRs的表達變化發揮健康促進的有益效應。

3 exomiRs介導運動促進心血管健康

3.1 exomiRs介導運動促進心臟健康

研究發現，exomiRs參與了心血管健康的調控。Ruan等（2018）研究發現，速效救心丸（心絞痛和冠心病的常用藥物）可以促進小鼠心肌間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來源EXO的分泌，抵抗缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）產生的心肌損傷。心肌祖細胞（cardiac progenitor cells，CPCs）來源的exomiR-133a可以降低心肌肥厚，抑制細胞凋亡，促進心臟收縮功能（Izarra et al.，2014）。CPCs來源的exomiR-451可以保護心肌細胞緩解氧化應激性損傷（Chen et al.，2013）。干細胞移植能促進壞死心臟區域心肌及血管再生，是心血管疾病治療中非常有應用前景的治療手段。造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）由骨髓向外周的運轉活力是影響移植效果的重要因素。富含miR-126的EVs能抑制骨髓HSCs血管細胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule1，VCAM1）的表達，促進HSCs向外周血的運轉（Salvucci et al.，2012）。Shao等（2017）研究發現，在心肌梗死（miocardial infarc?tion，MI）的治療中，胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）來源的EXO能抑制心肌纖維化、炎癥，改善心臟功能，治療MI比ESCs移植更有效，該研究發現，ESCs來源的exomiR-15、exomiR-21顯著富集是產生良好治療效果的原因。小鼠I/R前5 min注射MSCs來源EXO可增強心肌細胞活力，減少45%的梗死面積，保護心室的結構及收縮功能（Arslan et al.，2013），提示，EXO作為MI治療劑具有巨大潛力。MI發生后21天心臟疤痕組織已經形成，此時向心肌注射心肌球樣細胞（cardiosphere-derived cells，CDCs）來源EXO，可增加心肌細胞的存活、減少心臟的疤痕、改善心室射血功能，CDCs來源的exomiR-146a的抗氧化應激效應在緩解MI損傷，保護心臟功能中發揮了關鍵作用（Ibrahim et al.，2014）。以上研究證實，多種細胞來源的EXO通過特定exomiRs的調控緩解了病理狀態下心肌細胞的損傷，改善了心臟功能。

體育運動可以減少心肌梗死面積，促進CVD患者的心肺功能（石曉明 等，2017；Hou et al.，2019）。有研究證實，exomiRs參與了運動對心臟功能的調控。Brahmer等（2019）研究發現，中等強度的有氧運動引起血小板、白細胞、ECs等細胞來源EVs的釋放。急性MI發生后，運動康復誘導心臟分泌富含抗纖維化作用的exomiR-29b、exomiR-323-5p、exomiR-455、exomiR-466，上述exomiRs可以下調基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9），從而降低MI后的不良重塑（Chaturvedi et al.，2015）。Hou等（2019）建立大鼠MI模型并將長期運動者血漿EXO進行大鼠心外注射，發現運動誘導的血漿exomiR-342-5p可以靶向抑制caspase 9和c-Jun氨基末端激酶2（c-Jun N-terminal kinase enzyme，JNK2）基因的表達，降低心肌梗死面積，提高心室射血分數，對心肌產生保護效應。細胞實驗發現，長期運動者血漿EXO能抑制細胞凋亡，降低乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的分泌，增加細胞活力，緩解心肌細胞因缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）刺激而產生的損傷（Hou et al.，2019）。缺氧預處理可模擬機體運動中缺氧的特性，研究發現，缺氧預處理可以促進CPCs來源EXO的分泌，并使CPCs來源的exomiR-103、exomiR-15b、exomiR-292等7種exomiRs表達上調，參與ECs血管生成以及心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）分化相關的調控，將CPCs來源EXO通過心肌注射應用于I/R大鼠，可促進血管生成，減少心肌纖維化，改善心臟射血功能（Gray et al.，2015）。綜上，運動可以選擇性地促進特定細胞來源exomiRs的表達，運動以及模擬運動特性的刺激所誘導的exomiRs表達變化在促進心血管健康中發揮了關鍵作用（表1）。

表1 運動及模擬運動特性的實驗中exomiRs促進心血管健康的主要研究Table 1 The Main Research on the Promotion of Cardiovascular Health by exomiRs in the Experiments of Exercise and Simulated Exercise

3.2 exomiRs介導運動促進血管健康

伴隨老齡化的發展，高血壓、動脈粥樣硬化（athero?sclerosis，AS）等血管疾病高發。有研究發現，EXO以及exomiRs參與了血壓及血管鈣化的調節。Otani等（2018）將自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats， SHR）血漿EXO腹腔注射入正常大鼠體內能引起收縮壓升高、胸主動脈壁增厚、膠原減少和心室肌纖維化，相反將正常大鼠血漿EXO注射進SHR大鼠體內，能使收縮壓降低，心室肌纖維化得到緩解。骨髓MSCs來源EXO的運用可以降低高磷共孵育平滑肌細胞（smooth muscle cells， SMCs）的鈣含量和堿性磷酸酶活性，抑制SMCs的鈣化（Guo et al.，2019）。骨髓 MSCs來源 exomiR-146a可以靶向抑制SMCs硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）的活性，降低ROS的產生及SMCs的成骨樣分化，緩解糖基化終產物對血管SMCs的損傷（Wang et al.，2018）。MSCs來源EXO與CDCs共培養改變了CDCs中miRNAs的表達譜，在MI后促進CDCs的存活，降低心肌纖維化，增加毛細血管密度（Zhang et al.，2016）。當將人體CD34＋干細胞EXO注入小鼠缺血后肢（hind-limb ischemia，HL/I）時，可通過exomiR-126-3p抑制ECs出芽相關蛋白1（sprouty-related protein-1，SPRED1）的表達，改善缺血后肢毛細血管密度，促進后肢運動能力（Mathiyalagan et al.，2017）。Van Balkom等（2013）研究發現，ECs通過exomiR-214以自分泌的方式促進ECs的遷移、血管生成，改善毛細血管擴張失調。

運動可以促進血管的順應性，緩解動脈硬化，逆轉SMCs的不良表型轉化，提高其收縮功能（陳金鰲 等，2014；廖靜雯 等，2018；王帝之 等，2019）。有證據表明，exomiRs參與了運動對心血管調控的有益效應。少年男子自行車運動員急性運動中和運動后，調控血管功能的miR-126顯著增加（Kilian et al.，2016），而miR-126主要來自ECs并大量存在于循環EVs中（Jansen et al.，2014）。4周中等強度的跑臺運動（10 m/min，每天60 min，每周5天）可以上調EPCs來源exomiR-126水平，緩解高糖誘導的ECs凋亡，促進ECs的遷移及成管能力（Ma et al.，2018）。運動可以造成體內缺血、缺氧，能量需求及血流剪切應力增加等急性應激反應。用能量剝奪的體外實驗模擬在體運動狀態的研究發現，能量剝奪促進ECs分泌EVs，并將其富含的miR-126、miR-21轉運到 SMCs（Wahl et al.，2016），提示，在運動狀態下，EVs充當了ECs和SMCs之間信息交流及物質轉運的媒介，調控運動對血管的有益效應。另一項研究發現，能量剝奪促進心肌細胞釋放富含葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）、葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）、LDH和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase，GAPDH）的EXO，這些EXO被鄰近的ECs攝取，參與ECs的能量代謝調節（Garcia et al.，2016）。剪切應力增加是運動中血流產生的重要變化。體外研究發現，剪切應力刺激促進久坐者血小板來源EVs的釋放（Chen et al.，2010）。以剪切應力刺激人血管ECs可以促進EXO的分泌并上調exomiR-143、exomiR-145的表達，將EXO與SMCs共培養誘導了SMCs基因表達變化及表型轉化，緩解了載脂蛋白E（apolipopro?tein E， ApoE）基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的形成（Hergen?reider et al.，2012）。心肌缺血時供血供氧能力受損，而血管生成對于促進缺血心臟的再灌注和功能恢復至關重要。缺氧預處理可以促進CDCs來源EXO中exomiR-210、exomiR-130a和exomiR-126的表達上調，用CDCs來源EXO與血管ECs共培養后，可促進ECs的血管生成（Namazi et al.，2018）。以上在體及離體研究提示，多種細胞來源的EXO通過exomiRs在心血管細胞功能調控中發揮了關鍵作用（圖2）。exomiRs介導運動促進了體內多個系統的信息交流及物質轉運，在病理狀態下發揮對心血管系統的保護效應。

圖2 不同細胞來源exomiRs對心血管細胞的調控Figure 2. Regulation of Cardiovascular Cells by exomiRs from Different Cells

4 exomiRs在CVD中的未來應用展望

4.1 exomiRs作為CVD預測和診斷的生物標志

exomiRs表達譜受身體健康狀況影響，特定疾病會誘導體內產生特異性exomiRs（Garcia-Contreras et al.，2017）。在心肌病的診斷中，患者循環exomiR-133a在肌酸激酶、肌鈣蛋白等傳統生物標志物升高之前就發生了顯著升高（Kuwabara et al.，2011），提示，特定exomiRs在預測心肌病發病中具有很高的敏感性。在所有MI患者中，大約25%會在1年內發生心力衰竭而面臨死亡（Velagaleti et al.，2008）。Matsumoto等（2013）研究發現，急性MI后2～3周患者血清exomiR-194和exomiR-34a顯著增加，而這些exomiRs的水平增加更易于使患者在后期發展成心力衰竭。穩定型冠心病患者循環exomiR-199a、exomiR-126的水平與心血管不良事件發生風險呈負相關，而循環miR-199a和miR-126與心血管不良事件發生風險并無相關性（Jansen et al.，2014）。加之被脂質膜包裹免受RNA酶的降解（Cheng et al.，2014），循環exomiRs相比循環miRNAs能更加敏感而穩定地預測心血管健康狀態。此外，長期運動能上調循環exomiR-342-5p以及心源性exomiR-29b、exomiR-323-5p、exomiR-455、exomiR-466的表達，產生心血管保護效應（Chaturvedi et al.，2015；Hou et al.，2019），提示，在心肌梗死患者的運動康復中，可以通過測試上述exomiRs的表達判斷疾病進展及運動康復效果。相比臨床指標，exomiRs在CVD的診斷、病理發展、不良心血管事件發生風險預測中具有較高的敏感性，有望發展為CVD風險預測、臨床診斷以及運動康復效果評定的生物標志物。

4.2 exomiRs成為CVD靶向治療的新方法

運動通過調控EXO的代謝動力和exomiRs表達譜對心血管產生保護作用。干細胞來源的EXO具有母細胞的某些特性，可以降低心肌纖維化和不良重塑，促進血管增生，提高心血管功能，在CVD的治療中比母細胞產生更好的效果（Davidson et al.，2018）。加之EXO的純化、輸送和儲存比干細胞制備和輸送更加簡單和快捷。所以，收集健康年輕人或長期運動者的血液并制備EXO，將其注入CVD患者體內，有望成為治療CVD的新方法。EXO是轉運核酸的天然載體，相比現有的核酸載體具有更加優越的循環穩定性、生物相容性和較低的毒性（Lin et al.，2020）。隨著對EXO生物生成、包裝機制、生理特性的了解，未來通過基因技術將某些特定miRNAs裝載到EXO制備納米藥物，利用EXO歸巢能力強、靶外效應小的特點（Floriano et al.，2020；Tomasetti et al.，2017）實施無細胞靶向治療CVD，將成為可能。

5 結語

EXO分泌是體內存在的基本生理過程，分泌缺乏將誘發病理過程（Alexander et al.，2017）。運動促進了特定EXO的分泌，調控了exomiRs的表達譜，exomiRs介導運動在促進心血管健康方面發揮了重要作用，在臨床CVD的預防、診斷及治療中具有很好的應用前景。但是，目前的研究與臨床應用還有一定距離，某些問題尚待進一步闡釋：1）EXO的粒徑范圍與EVs中微囊泡的粒徑范圍出現重疊（Lawson et al.，2016），不同研究中EXO粒徑的界定也有分歧（Lawson et al.，2016；Pluchino et al.，2019），需在未來研究中規范EXO的粒徑范圍，確保研究結果的準確性。2）鮮見exomiRs介導運動調控心血管健康的研究，尤其是在體研究。后期尚需加大研究力度，期望臨床實現運動處方科學指導運動來調控exomiRs的表達，從而達到內源性非藥物治療CVD的目的。3）不同細胞來源EXO的半衰期不同（Saunderson et al.，2014；Takahashi et al.，2013），不同注射途徑也會影響EXO在體內的分布（Zhou et al.，2020）。因此，后期在EXO的代謝動力學方面還需深入研究，以便能在臨床應用中尋找治療CVD的最佳注射時間和注射途徑。