植物乳桿菌C010產細菌素的分離純化及理化穩定性分析

張漫敏，曾祥益，方利敏，徐靜宇，程新，姚明印，黃林，*

1(生物科學與工程學院，江西省農業微生物資源開發與利用工程實驗室，江西農業大學應用微生物研究所 (江西農業大學)，江西 南昌，330045)2(江西省現代農業裝備重點實驗，江西 南昌，330045)

乳酸菌可產多種抑菌活性物質，已被研究報道的主要有：乳酸、乙酸、苯乳酸、細菌素、reuterin、reutericyclin[1]等。細菌素是某些細菌分泌的一類具有抗菌生物活性的多肽或蛋白質類物質，它在較低濃度下具有很強的抗菌活性，且因其安全、無毒、易被人體消化，不產生耐藥性，添加至食品中不會對感官品質造成影響等特性，顯示了細菌素在食品保鮮方面的巨大潛力[2-5]。目前研究最為深入的細菌素是乳酸鏈球菌素(Nisin)，它作為食品添加劑已被50多個國家授權使用，但因其抑菌譜窄、pH耐受性較差使其應用受限[6-7]。RASHEED等[8]從發酵乳桿菌BZ532(LactobacillusfermentumBZ532)中分離出新型細菌素LF-BZ532，對多種食品病原菌具有廣譜抑菌活性。AN等[9]從植物乳桿菌M1-UVs300 (LactobacillusplantarumM1-UVs300)中分離出新型細菌素M1-UVs300，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌具有廣譜抗菌活性；HU等[10]分離出LactobacillusalimentariusFM-MM4細菌素對細菌及酵母菌具有廣譜抗菌活性。GAO等[11]分離到一株新型的抑菌廣譜、且對熱和低pH表現出抗性的Ⅱa類細菌素(GarviecinLG34)產生菌；辛維崗等[12]分離出細菌素LSP01，對大腸桿菌(Escherichiacoli)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等12株致病菌具有良好的抑制效果，且對熱和pH表現出良好抗性。

細菌素被認為是一種潛在的生物防腐劑，到目前為止，已被發現的細菌素有數百余種，但真正商業化的只有Nisin和pediocin PA-1，其余僅限于實驗研究[13-14]。不同細菌素抑菌效率和抑菌特性各有不同，且同一細菌素在不同條件下抑菌活性有所不同，不同的外部環境也會影響細菌素的結構、性質和抑菌效果。因此，尋找新型細菌素并探究其抑菌穩定性，對其后續研究及應用具有極其重要的意義。

課題組此前從新鮮牛糞中分離鑒定出LactobacillusplantarumC010，并初步確定可產細菌素[15]。試驗在前期L.plantarumC010液體發酵工藝優化及誘導調控作用提高細菌素產量研究基礎上[16]，采用硫酸銨沉淀法、有機試劑萃取法和pH吸附解吸法粗提L.plantarumC010所產細菌素，并通過Sephadex G-25、Sephadex LH-20凝膠層析結合半制備高效液相色譜進一步純化，對其結構和理化穩定性進行分析，以期為植物乳桿菌C010所產細菌素的分離提取、開發應用提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

試驗菌株：L.plantarumC010由課題組從新鮮牛糞中自行分離鑒定保存，所用培養基為MRS培養基。

指示菌：革蘭氏陰性細菌韓國假單胞菌PS1(PseudomonaskoreensisPS1)、革蘭氏陽性細菌梭狀芽孢桿菌J4(BacillusfusiformisJ4)均為課題組從腐敗冷卻豬肉中自行分離保存的特定優勢腐敗菌株[17]，所用培養基為LB培養基。

1.1.2 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ半制備型液相色譜，Agilent 1260分析型高效液相色譜，中國安捷倫科技有限公司；Bruker DRX-500MHz核磁共振光譜儀，布魯克德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1L.plantarumC010發酵液的制備

將活化后的L.plantarumC010種子液以2%(體積分數)的接種量接入新鮮MRS培養基中，37 ℃下靜置培養至生長穩定期，即為L.plantarumC010發酵液。取3 000 mL發酵液于6 000 r/min離心10 min，去沉淀，保留無細胞上清液用0.22 μm無菌濾膜抽濾后于-20 ℃冷藏備用。

1.2.2L.plantarumC010產細菌素初步提取及比較

采用硫酸銨沉淀法、有機試劑萃取法和pH吸附解析法從L.plantarumC010發酵液中初步提取細菌素：(1)硫酸銨沉淀法：將上述上清液50 mL加入不同含量的硫酸銨中，使硫酸銨終飽和度分別為40%、50%、60%、70%、80%和90%，鹽析12 h后離心，所得沉淀用1 mL pH 6.0磷酸緩沖液溶解；(2)有機試劑萃取法：①有機試劑的選擇：將上述上清液50 mL分別與乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、甲醇、三氯甲烷以1∶1(體積比)萃取，所得萃取液于合適溫度下旋干并用1 mL pH 6.0磷酸緩沖液溶解，同時將50 mL上清液旋蒸至1 mL作為對照組；②抽提比例的優化：選取較優有機試劑與發酵上清液分別以1∶1、2∶1、3∶1和 4∶1 (體積比)進行萃取，所得萃取液旋干并用1 mL pH 6.0的磷酸緩沖液溶解；(3)pH吸附解析法：參照顧雅昕等[14]方法并加以修改。將上述發酵液50 mL于70 ℃水浴30 min，以殺死活性細胞及鈍化酶活力，用NaOH溶液分別調pH至5.5、5.8、6.1、6.4、6.7、7.0，磁力攪拌1 h使細菌素充分吸附在細胞膜表面，6 000 r/min離心10 min去除菌體，用pH 7.0磷酸緩沖液充分洗滌菌體，用HCl溶液將pH分別調至1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1解析1 h，離心所得上清液經冷凍干燥得到粗提粉末，用1 mL pH 6.0磷酸緩沖液溶解；(4)粗提細菌素抑菌活性的檢測：將上述粗提品分別以P.koreensisPS1、B.fusiformisJ4為指示菌，采用牛津杯雙層瓊脂擴散法測定不同處理下粗提細菌素的抑菌效果，用十字交叉法測定其抑菌圈直徑。每個處理重復3次。

1.2.3L.plantarumC010產細菌素的分離純化

將2 mL抑菌效果較好的粗品經0.22 μm微膜過濾，以pH 6.0磷酸緩沖液為流動相上樣于葡聚糖凝膠Sephadex G-25層析柱(直徑1.6 cm×柱高60 cm)中，自動收集各餾分，以P.koreensisPS1為指示菌測定抑菌活性，所得具有活性的餾分旋干后用80%(體積分數，下同)甲醇等體積復溶，用Sephadex LH-20層析柱(直徑1.6 cm×柱高120 cm)進一步純化，以80%色譜級甲醇為流動相，自動收集各餾分，按上述方法驗證活性后，將具有活性的餾分用紫外分光光度計在波長190～700 nm進行掃描，其最大吸收峰作為HPLC的檢測波長。

1.2.4 半制備高效液相色譜純化

將經過Sephadex LH-20純化得到的活性組分用0.22 μm微膜過濾，用島津半制備液相LC-20AR色譜Venusil XBP C18柱進一步純化。制備條件為：A液：含0.1%(體積分數，下同)甲酸的水；B液：含0.1%甲酸的乙腈；上樣量0.5 mL，檢測波長215 nm，流速1 mL/min，洗脫程序為：0～20 min，流動相B 0%～60%, 20～25 min，流動相B 60%～100%，25～30 min，流動相B保持100%，收集具有抑菌活性的液相色譜洗脫組分，所得活性洗脫組分重新上樣于高效液相色譜，檢測其純度并于冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱儲存。

1.2.5 細菌素純度及分子質量的檢測

將半制備高效液相色譜收集得到的具有抑菌活性的組分用HPLC檢驗純度[9]。樣品經0.22 μm微膜過濾，用安捷倫1260高效液相色譜ZORBX Eclipse Plus C18檢測，檢測條件為：A液：含0.1%(體積分數，下同)三氟乙酸的水；B液：含0.1%三氟乙酸的乙腈；上樣量0.1 mL，檢測波長215 nm，流速1 mL/min，洗脫程序為：0～20 min，流動相B 0%～60%，20～25 min，流動相B 60%～100%，25～30 min，流動相B保持100%。

1.2.6 細菌素的結構鑒定

采用DFS快原子轟擊離子源質譜儀對該單一活性組分進行分子量測定，電轟擊電離模式(electron ionization mass spectrometry,EI-MS)檢測，并用Bruker DRX-500MHz核磁共振光譜儀進一步解析其結構。

1.2.7 細菌素理化穩定性測定

熱穩定性實驗：將提純樣品粉末用去離子水復溶后于60、80、100 ℃水浴60 min，121 ℃處理20 min，待溫度恢復至室溫檢測抑菌活性。

pH穩定性實驗：將提純樣品粉末用去離子水復溶后，用1 mol/L HCl溶液分別將pH值調至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，并以不調pH的溶液為陰性對照，同等pH值的HCl溶液為陽性對照，37 ℃下處理測定其抑菌活性。

酶解穩定性實驗：將提純樣品粉末用去離子水復溶后調至胰蛋白酶、胃蛋白酶、過氧化氫酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶K等的最適pH，加入終質量濃度為2 mg/mL的酶，于最適溫度下反應2 h，調回pH檢測抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 L.plantarum C010產細菌素的粗提結果

試驗采用3種不同方法對L.plantarumC010產細菌素進行粗提，通過雙層瓊脂平板擴散法以冷卻豬肉特定致腐菌P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4為指示菌進行抑菌活性檢測。

由表1、表2可知，在硫酸銨鹽析法中，隨著溶解度的升高，抑菌效果增強，在飽和度為80%時抑菌效果最佳。在有機試劑萃取法中，乙酸乙酯和正丁醇提取活性物質對特定致腐菌P.koreensisPS1、B.fusiformisJ4的抑菌效果接近于上清濃縮液，顯著高于甲醇、乙醇和三氯甲烷。但正丁醇沸點大于乙酸乙酯，不利于后期有機試劑的旋轉蒸發，之后進一步將乙酸乙酯和發酵上清液按不同體積比進行萃取。V(乙酸乙酯)∶V(上清液)=4∶1時，提取的活性物質抑菌效果最佳。乙酸乙酯萃取時會伴隨棕褐色物質的聚沉，推測為雜質蛋白，但不影響對該細菌素的萃取，萃取效率較高。

表1 L.plantarum C010發酵液硫酸銨和有機試劑提取細菌素的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of bacteriocin from L.plantarum C010 by saturated ammonium sulfate and ethyl acetate extraction

如表2所示，在吸附解析中，利用單因素變量法優化吸附和解析pH時，當吸附pH為6.7、解析pH為1.8時提取活性物質抑菌效果最佳，但該法提取效率仍低于乙酸乙酯萃取法。因此，在L.plantarumC010發酵上清液細菌素提取中，乙酸乙酯萃取優于pH吸附解析和硫酸銨沉淀法。DüNDAR等[18]對屎腸球菌(Enterococcusfaecium) W3細菌素提取過程中，pH吸附解吸法得到的樣品活性為原上清液活性的16%，約是硫酸銨沉淀法的4倍。顧雅昕等[14]對發酵乳桿菌LBM97所產細菌素提取進行比較，發現硫酸銨沉淀法、乙酸乙酯抽提法和pH吸附解吸法均能獲得目的蛋白，且pH吸附解吸法得到的細菌素樣品表現出最穩定的抑菌活性?？梢姴煌N發酵液中細菌素的適宜提取方法存在差異，這可能與細菌種屬以及存在環境的差異有關，也可能與細菌素本身的理化性質如分子質量大小、親疏水性等的差異有關。

表2 L.plantarum C010發酵液pH吸附解析提取細菌素抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of bacteriocin from L.plantarum C010 by pH adsorption/desorption

2.2 L.plantarum C010產細菌素的凝膠層析

發酵上清液經乙酸乙酯萃取后，經Sephadex G-25凝膠得到的各餾分對特定致腐菌P.koreensisPS1進行抑菌活性檢測，在22～26管收集液中具有明顯的抑菌活性(圖1-a)；將這些收集液合并再經Sephadex LH-20凝膠層析，測得第17～22管之間的層析組分液均具有較強抑菌活性(圖1-b)。該抑菌活性組分液在波長215 nm處有明顯的紫外吸收峰，故選取215 nm作為高效液相色譜純化檢測波長。

a-G-25層析洗脫曲線；b-LH-20層析洗脫曲線圖1 Sephadex層析曲線Fig.1 The elution curve of Sephadex

2.3 L.plantarum C010產細菌素的半制備高效液相色譜純化

反相高效液相色譜是純化細菌素的高效方法，據前人[8,19-20]報道采用該方法純化得到了細菌素。由圖2可知，在L.plantarumC010發酵上清液抑菌活性組分液中仍存在多種物質，但僅在5.894 min的收集液具有較強抑菌活性，其對特定致腐菌P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4抑菌圈直徑分別為15.12和18.46 mm，故選擇該組分進行下一步純化。

圖2 L.plantarum C010抑菌活性組分的半制備高效液相色譜圖Fig.2 Semi-preparative HPLC graph of antibacterial active components from L.plantarum C010

2.4 L.plantarum C010產細菌素的純度及分子質量檢測

將經半制備高效液相色譜純化得到的抑菌活性組分液經HPLC檢驗純度達90%以上，將上述純化得到的單一抑菌活性組分物質經EI質譜分析，得出該組分物質分子質量為260.116 1 Da(圖3)。

核磁共振圖譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)分析數據如下：1H NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 7.34～7.17 (m,5H),4.48 (td,J=5.1,1.9 Hz,1H),4.36 (ddd,J=11.7,5.9,1.9 Hz,1H),4.27 (t,J=4.8 Hz,1H),3.79～3.64 (m,1H),3.16 (t,J=4.6 Hz,2H),2.10～2.01 (m,1H),1.36 (ddd,J=12.9,11.7,4.6 Hz,1H),1.04～0.87 (m,1H).13C NMR (126 MHz,MeOD) δ 171.24,167.08,137.38,131.00,129.46,128.06,68.51,58.32,57.59,55.23,38.86,37.98。結合NMR譜推測分子式為C14H16N2O3。經查閱，該核磁共振圖譜與文獻[21]基本一致，該化合物鑒定為環(L-苯丙氨酰-反式-4-羥基-L-脯氨酸[Cyclo(L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro])二肽[22]，命名為細菌素Plantarum C010。按分子質量大小可以將其劃分為Ⅰ類細菌素。該細菌素雖然早在2000年被發現[23]，但是關于它的抑菌活性的研究較少；常見于內生放線菌、分歧桿菌、鏈霉菌等菌屬中[21]，但首次從乳酸菌屬中分離提取得到該物質。如ERAM等[24]明確指出Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽具有抑菌活性，但未做深入研究。KHALIL等[25]從澳大利亞淺水海灘的細菌中得到該物質，且具有抑真菌活性。LEE等[26]從海洋細菌灰鏈霉菌中提取的該物質具有抗HL-60癌細胞活性。

a-EI質譜圖；b-核磁共振1H譜圖；c-結構式圖3 L.plantarum C010細菌素EI質譜圖、1H NMR圖譜及化學結構式Fig.3 EI mass spectra, 1H NMR spectrum and chemical structural formula of bacteriocin from L.plantarum C010

2.5 細菌素Plantarum C010理化穩定性分析結果

目前，已關于Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽的研究報道，其理化穩定性的研究甚少，且不同細菌素抑菌效率和抑菌特性各有不同，同一細菌素在不同條件下抑菌活性也有所不同，不同外部環境也會影響細菌素的結構、性質和抑菌效果。故細菌素的抑菌穩定性在很大程度上決定了其實際應用價值。因此，探究細菌素在環境中的穩定性對其后續研究及應用具有極其重要的意義。

表3結果表明，細菌素Plantarum C010在不同溫度處理下對B.fusiformisJ4抑菌活性沒有表現出顯著性差異，而在121 ℃處理20 min條件下對P.koreensisPS1抑菌活性略有下降，但相較于CK組仍然保持95%以上抑菌活性，說明該細菌素具有較強的耐熱穩定性。

表3 L.plantarum C010產細菌素抑菌穩定性Table 3 Bacteriostatic stability of bacteriocin from L.plantarum C010

在細菌素耐受pH試驗中，同等pH下的鹽酸對P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4均沒有抑菌活性，說明不是酸引起的抑菌作用，而是細菌素產生的抑菌效果。由表3可知，在pH為3.0～5.5時，細菌素具有較強抑菌活性，當pH在5.0～6.0時，抑菌活性顯著減弱甚至失活。

在細菌素酶解試驗中，利用胰蛋白酶、胃蛋白酶、過氧化氫酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶K分別處理純化后的細菌素，對P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4抑菌活性均無明顯改變(表3)。這與EL-GENDY等[27]所研究的細菌素enterocin OS13β一樣耐高溫和具有多重酶等特性，說明該細菌素不具有大分子蛋白質屬性，或者說是一種不具有某些特異性酶切位點的小肽類化學物質。

綜上所述，本研究從植物乳桿菌C010發酵上清液中分離純化的細菌素Plantarum C010，具有較好的熱穩定性，這可能與Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽的環形結構有關，使其相對于簡單二肽類化合物的穩定性更強。其次，當pH>5.5時，環二肽失活可能由于羥脯氨酸中的羧基發生化學反應形成酯，導致二肽的環型結構被破壞，活性相應降低甚至失活。此外，與近年來的新型小分子肽細菌素[8-12]相比，該Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽細菌素對上述6種酶均具有較強的耐受性，也使其具有更好的應用潛力。

3 結論

本研究采用3種不同提取方法對L.plantarumC010所產細菌素的提取效果進行比對分析，提取效率為：乙酸乙酯>吸附解析>硫酸銨鹽析；采用“三步法”分離純化L.plantarumC010細菌素：乙酸乙酯萃取、Sephadex凝膠層析、半制備高效液相色譜，獲得單一抑菌活性組分物質，經質譜和核磁共振解析發現該物質是分子質量為260.116 1 Da的Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽類化合物，命名為細菌素Plantarum C010，并首次發現于植物乳桿菌屬。目前，該細菌素的抗菌特性研究較少，僅證實了對真菌和癌細胞有抑制作用。本研究證實了該細菌素對革蘭氏陽性細菌B.fusiformisJ4和革蘭氏陰性細菌P.koreensisPS1均具有較強的抑制活性，且耐熱性強，在121 ℃處理20 min對特定致腐菌P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4抑菌活性仍為96.57%和101.5%；該細菌素在pH 3.0～5.0時，具有較強抑菌活性，但在pH>5.0時抑菌活性顯著下降甚至失活；經過氧化氫酶、脂肪酶、淀粉酶及蛋白酶等處理該細菌素抑菌活性無明顯改變。該結果豐富了植物乳桿菌所產抗菌活性產物的多樣性，同時，為L.plantarumC010所產細菌素的分離純化及保鮮應用提供理論基礎和數據支持。