餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸菌種的篩選、鑒定及應(yīng)用

余培斌，吳殿輝，蔡國(guó)林，陸健

1(糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

餐廚垃圾是城市生活垃圾的重要組成部分，是指家庭、學(xué)校、機(jī)關(guān)、公共食堂以及餐飲行業(yè)的食物廢料、餐飲剩余物、食品加工廢料等各類混合物[1]。隨著人民生活水平日益提高，餐廚垃圾數(shù)量也在不斷增加，一般可以達(dá)到生活垃圾總量的30%～50%，每年還在以8%～10%的速度增長(zhǎng)[2]。如何簡(jiǎn)單高效地處理餐廚垃圾，實(shí)現(xiàn)餐廚垃圾的減量化、資源化和無害化已經(jīng)成為目前需要迫切解決的難題[3]。從化學(xué)組成上看，餐廚垃圾主要為淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪和少量無機(jī)鹽等幾大常見類別[4]。餐廚垃圾憑借高有機(jī)物、高含水率、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，成為寶貴的可再生資源，蘊(yùn)含著較大的回收和再利用價(jià)值[5-7]。微生物處理技術(shù)由于其具有高效環(huán)保的優(yōu)勢(shì)，在餐廚垃圾資源化利用方面越來越受到人們的重視[8-10]。

乳酸作為一種重要的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、化工等領(lǐng)域，聚乳酸類可生物降解塑料的開發(fā)使包裝材料的白色污染問題得到減輕[11]。目前，乳酸的工業(yè)生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[12]。化學(xué)合成法生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重且較難合成單一構(gòu)型的乳酸，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸不僅可以克服上述弊端，還具有發(fā)酵條件溫和、過程清潔、效率高等優(yōu)點(diǎn)[13]。因此微生物發(fā)酵產(chǎn)乳酸的研究越來越受到關(guān)注[14]。其中，利用充足且低成本的發(fā)酵原料(如餐廚垃圾等有機(jī)廢棄物)厭氧發(fā)酵產(chǎn)乳酸既能獲得品質(zhì)較高的乳酸，又可以在實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢物自身減量的同時(shí)達(dá)到變廢為寶的目的，因此逐漸成為餐廚垃圾資源化利用研究中的一個(gè)重要方向[15-17]。

本研究從自然發(fā)酵完全腐熟的餐廚垃圾有機(jī)肥料中，篩選出適合餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸的土著乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定和耐受性研究，豐富餐廚垃圾乳酸發(fā)酵理論，以期為餐廚垃圾回收再利用提供更多的信息，為篩選適合國(guó)內(nèi)餐廚垃圾發(fā)酵乳酸的菌劑提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

樣品來源：取自江南大學(xué)食堂，經(jīng)過預(yù)處理的餐廚垃圾分別堆放于不同土壤環(huán)境中至完全腐熟，采集樣品于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

枯草芽孢桿菌YB1，本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏菌種；大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑

K2HPO4、乙酸鈉、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、檸檬酸氫二銨、葡萄糖、吐溫-80、NaOH、溴甲酚紫、牛肉浸膏、酵母膏、KH2PO4,均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaCl工作基準(zhǔn)試劑，優(yōu)級(jí)純，天津市化學(xué)試劑三廠；瓊脂粉、蛋白胨，均為化學(xué)純，阿拉丁試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.4～7.6。

MRS液體培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO410.0，乙酸鈉5.0，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.25，檸檬酸氫二銨2.0，葡萄糖5.0，蛋白胨10.0，吐溫-80 1.0，牛肉膏10.0，酵母膏5.0，pH 6.4。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加2%瓊脂，1.6%溴甲酚紫1.5 mL。

餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基：餐廚垃圾經(jīng)過分揀后打碎成泥狀，取濕基200 g，水500 mL，混合均勻，加入輔料麩皮，調(diào)節(jié)C/N比25∶1～30∶1，同時(shí)加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CaCO3，不滅菌。

1.1.4 主要儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DFP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；全鋼通風(fēng)柜，無錫市普瑞達(dá)實(shí)驗(yàn)裝備有限公司；FE20型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；W201-D恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì)，日本島津有限公司；XSP-8C生物顯微鏡，上海精密儀器儀表有限公司；TC-5000PCR 儀，英國(guó)Techne公司；Pico 17型離心機(jī)，Thermo Scientific公司；雙人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化集團(tuán)安泰公司；高壓蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；精度磅秤，上海耀華稱重系統(tǒng)有限公司；超聲波破碎儀，美國(guó)Sonics公司；漩渦振蕩儀，Sigma公司；M-100型生物傳感器分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的初篩與分離純化

菌種富集：稱取堆肥樣品20 g，加入已滅菌的裝有適量玻璃珠的MRS液體培養(yǎng)基(250 mL三角瓶，180 mL培養(yǎng)液)，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h以上。

菌種初篩：取富集培養(yǎng)的菌液0.1 mL加入到已滅菌的裝有0.9 mL無菌水的試管中，漩渦混勻，依次梯度稀釋得10-1～10-6的菌液。取10-4、10-5、10-63個(gè)梯度各0.2 mL稀釋菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，共做3個(gè)平行，37 ℃真空培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h以上觀察。

菌種分離純化：挑選能夠在MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色的單菌落，對(duì)菌落進(jìn)行編號(hào)，然后接種到新鮮MRS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。反復(fù)進(jìn)行同樣的操作2～3次，直至分離出的單菌落形態(tài)穩(wěn)定一致。

菌種保藏：將獲得的單菌落轉(zhuǎn)接于MRS斜面培養(yǎng)基上，待菌落在斜面生長(zhǎng)良好后將其置于4 ℃冰箱保藏。同時(shí)轉(zhuǎn)接2組，一組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。

1.2.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定

平板菌落觀察：將分離的菌種分別接種到MRS固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后觀察菌落的大小、顏色、形態(tài)等特征。

顯微形態(tài)觀察：依據(jù)革蘭氏染色原理，顯微觀察菌體染色情況及菌體形態(tài)。將通過實(shí)驗(yàn)獲取的革蘭氏陽性菌(G+)暫定為乳酸菌并進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 菌株的生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[18-20]考察疑似乳酸菌菌株的生理生化特征。通過過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、H2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等，對(duì)菌種進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

1.2.4 菌種耐受性試驗(yàn)

取活化后菌種懸液按5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量接種于NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～9%及pH 3～8的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h后取樣。在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定培養(yǎng)液的OD值，不接菌的培養(yǎng)液OD值為空白對(duì)照，比較觀察菌種生長(zhǎng)狀況判斷菌種對(duì)鹽度和酸堿度耐受性。取活化菌懸液按照5%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度(35～60 ℃)真空培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后取樣。同樣通過比較600 nm處培養(yǎng)液OD值判斷菌種對(duì)溫度的耐受性。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌16S rDNA提取與擴(kuò)增專用試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物，正向引物5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，反向引物5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。PCR反應(yīng)體系為50 μL反應(yīng)體系：4 μL裂解上清液，25 μL PCR Premix Taq，正向引物與反向引物各0.5 μL，20 μL超純水。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，(94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min)×30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送樣至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

獲得序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST并利用DNAMAN 4.0、MEGA 5.1軟件進(jìn)行多重序列比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)定為1 000。

1.2.6 乳酸含量測(cè)定

采用酶電極法，利用生物傳感分析儀M-100測(cè)定。

1.2.7 菌種抑菌性試驗(yàn)

采用管碟法測(cè)定篩選菌種對(duì)枯草芽孢桿菌YB1和大腸桿菌的抑菌性。將篩選菌株接種于10 mL MRS培養(yǎng)液中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h待用。將指示菌接種至LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取100 μL稀釋100倍的培養(yǎng)液涂布于LB固體培養(yǎng)基平板，在超凈臺(tái)上將滅好菌的牛津杯按在已涂布指示菌的平板上，向各牛津杯中分別注入100 μL篩選菌株培養(yǎng)液，觀察牛津杯周圍抑菌圈情況。

1.2.8 餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸試驗(yàn)

取200 mL的餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基置于250 mL錐形瓶中，先接入枯草芽孢桿菌YB1，后接入篩選得到的乳酸菌混合菌劑，接種量均為5%，于45 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔6 h測(cè)定乳酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和篩選

從不同環(huán)境中腐熟的餐廚垃圾有機(jī)肥中取得堆肥樣品共計(jì)15份。經(jīng)過MRS培養(yǎng)基平板劃線，共獲得34株能在MRS平板上生長(zhǎng)，使培養(yǎng)基變成黃色并產(chǎn)生形態(tài)各異的菌株。

通過菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)觀察，排除相似及疑似菌株后共獲得6株形態(tài)各異的菌株，分別編號(hào)為B1、M2、M3、M4、M5和M6。將這6株菌在MRS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行三區(qū)劃線，待長(zhǎng)出單菌落后，觀察菌落形態(tài)，如圖1所示。

a-B1;b-M2;c-M3;d-M4;e-M5;f-M6圖1 篩選菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the screened strains

將篩選到的6株菌株進(jìn)行革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡(10×100)油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征及染色情況，菌株顯微形態(tài)見圖2。

由圖2可知，6株菌均為革蘭氏陽性菌，能在MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并使培養(yǎng)基變色。M2和M4為球形或近似球形，B1、M3和M5為短桿狀，M6為長(zhǎng)桿狀。經(jīng)過與乳酸菌常見形態(tài)比對(duì)發(fā)現(xiàn)6株菌符合其基本屬性，初步確定為疑似乳酸菌并作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

a-B1;b-M2;c-M3;d-M4;e-M5;f-M6圖2 篩選菌株的顯微形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology of the screened strains

2.2 菌株的生理生化特征

對(duì)6株疑似乳酸菌進(jìn)行接觸酶實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)等，各菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 篩選菌株生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the screened strains

將表中結(jié)果與《乳酸細(xì)菌分離鑒定及試驗(yàn)方法》[21]和《伯杰氏手冊(cè)》對(duì)照，確定篩選所得6株疑似乳酸菌均符合乳酸菌生理生化特征，具備分子鑒定前提條件，初步將其劃分列入乳酸菌。

2.3 菌株的耐受性

餐廚垃圾在自然發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中心溫度能較長(zhǎng)時(shí)間保持在50 ℃以上，在這種溫度環(huán)境中一般的微生物很難生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)酵過程中，隨著微生物的不斷作用，培養(yǎng)基中酸堿度變化加大，會(huì)影響菌種的活性。其次餐廚垃圾的高含鹽率也是我國(guó)餐廚垃圾區(qū)別于其他國(guó)家的主要特征。已有研究表明，中國(guó)不同地區(qū)的不同飲食習(xí)慣導(dǎo)致餐廚垃圾中含鹽率有很大的差異[22]。鹽對(duì)微生物具有Na+毒性，未經(jīng)馴化的微生物在Na+質(zhì)量濃度為500～2 000 mg/L時(shí)即受輕度抑制[23]。且對(duì)于一般微生物而言，高鹽度會(huì)直接抑制其厭氧發(fā)酵過程，從而影響有機(jī)酸的生成[24]。因此篩選具有高溫耐受性、酸堿耐受性和高鹽耐受性的微生物十分重要。

2.3.1 溫度耐受性

將6株乳酸菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于不同溫度下厭氧培養(yǎng)24 h，紫外分光光度計(jì)測(cè)量600 nm處吸光值。各菌株及空白對(duì)照吸光值如圖3所示。

圖3 不同溫度下乳酸菌生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of lactic acid bacteria at different temperatures

由圖3可知，6株乳酸菌在35～50 ℃下生長(zhǎng)旺盛，對(duì)溫度有良好的適應(yīng)性。溫度≥55 ℃時(shí)生長(zhǎng)能力明顯減弱，其中M4、M5和M6在45 ℃均表現(xiàn)出最強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。一定范圍內(nèi)，菌株的生長(zhǎng)能力隨溫度的升高而變強(qiáng)，達(dá)到最適生長(zhǎng)溫度后生長(zhǎng)能力隨著溫度的升高而降低。一般情況下乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃，本實(shí)驗(yàn)中乳酸菌M4、M5和M6生長(zhǎng)情況不適用于此規(guī)律。推測(cè)原因可能是本實(shí)驗(yàn)獲得的乳酸菌菌株均篩選于餐廚垃圾堆肥后的有機(jī)肥樣品，餐廚垃圾在堆肥過程中，肥堆中心溫度長(zhǎng)期穩(wěn)定在40～50 ℃。本實(shí)驗(yàn)中乳酸菌經(jīng)高溫環(huán)境長(zhǎng)期馴化，對(duì)高溫的適應(yīng)能力增強(qiáng)。

2.3.2 鹽度耐受性

將6株乳酸菌分別接種到不同鹽度(NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～9%)的MRS液體中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，紫外分光光度計(jì)測(cè)量600 nm處吸光值。各菌株及空白對(duì)照吸光值如圖4所示。

圖4 不同鹽度下乳酸菌生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of lactic acid bacteria at different salt concentrations

篩選得到的6株菌對(duì)培養(yǎng)基中的NaCl均有一定耐受性，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)<7%時(shí)各菌株均有一定生長(zhǎng)表現(xiàn)。總體而言，篩選得到的6株菌生長(zhǎng)情況隨著鹽濃度的增大而不斷減弱，特別是NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)>7%以后，菌株生長(zhǎng)嚴(yán)重受限。菌株之間相互比較發(fā)現(xiàn)：B1、M2和M3對(duì)鹽度的耐受性總體較差，M4、M5和M6總體耐受性較強(qiáng)。當(dāng)超過7%時(shí)，M4、M5和M6還能表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)能力。

2.3.3 酸堿度耐受性

將6株乳酸菌分別接種到不同pH的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，紫外分光光度計(jì)測(cè)量600 nm處吸光值。各菌株及空白對(duì)照吸光值如圖5所示。

圖5 不同酸堿度下乳酸菌生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of lactic acid bacteria at different pH levels

由圖5可知，pH的變化對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)影響較大。6株乳酸菌pH在3～8范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，在pH為4～5時(shí)生長(zhǎng)能力最強(qiáng)。此后生長(zhǎng)能力隨pH的增加而呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，其中B1和M2下降明顯，當(dāng)pH值增加至8時(shí)，其生長(zhǎng)受到極大限制。M4下降較為平穩(wěn)，M3、M5和M6則均勻緩慢下降，這4株菌在堿性條件下依然能夠生長(zhǎng)。且M4和M6在pH為8時(shí)生長(zhǎng)情況也表現(xiàn)較好。綜上所述，本次篩選的菌株不僅能在偏堿性條件下生長(zhǎng)，且具有較好的耐酸性能，實(shí)際生產(chǎn)中具有一定的實(shí)用性。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

綜合考慮各菌株的溫度耐受性、酸堿耐受性及含鹽量耐受性，取M4、M5和M6作為潛力菌株，用于后續(xù)餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸試驗(yàn)，使用試劑盒擴(kuò)增3株菌的16S rDNA序列片段，并送上海生工公司測(cè)序，將各菌株的堿基序列輸入NCBI，應(yīng)用BLAST程序，將所得序列與數(shù)據(jù)庫中存在的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)，取其與結(jié)果顯示相似度最近的菌，結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2。

由表2可知，3株菌的序列比對(duì)相似性都達(dá)到了99%，綜合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確定M4、M5和M6為乳酸菌。其中，M4為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，M5為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，M6為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

2.5 篩選乳酸菌株的抑菌性

實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌YB1和大腸桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。枯草芽孢桿菌YB1為本實(shí)驗(yàn)室從餐廚垃圾自然堆肥后完全腐熟的有機(jī)肥樣品中篩選得到，具有耐鹽、耐高溫特性，并且產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶能力較強(qiáng)，具體特征見文獻(xiàn)[25]。在平板上，其中3個(gè)牛津杯內(nèi)分別添加篩選得到的乳酸菌株M4、M5和M6，另一個(gè)為添加相應(yīng)抗生素的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

a-枯草芽孢桿菌YB1；b-大腸桿菌圖6 篩選乳酸菌對(duì)指示菌的抑菌效果Fig.6 Screening of lactic acid bacteria for bacterial inhibition against indicator bacteria注：KAN-卡那霉素；AMP-氨芐西林

乳酸菌株M4、M5和M6對(duì)大腸桿菌具有一定的抑菌性，而對(duì)枯草芽孢桿菌YB1沒有抑菌性，可與枯草芽孢桿菌YB1相互混合制備混合菌劑，用于后續(xù)餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸研究。

2.6 復(fù)合菌劑發(fā)酵餐廚垃圾產(chǎn)乳酸

枯草芽孢桿菌菌種制備：將枯草芽孢桿菌YB1接種至LB液體培養(yǎng)基(含NaCl 6%)，45 ℃培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)液作為接種菌種。

乳酸菌復(fù)合菌劑的制備：將篩選獲得的M4、M5和M6這3株潛力菌株在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含NaCl 6%)，45 ℃培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)液按體積比1∶1∶1混合制作組合菌劑。

在接種枯草芽孢桿菌后，實(shí)驗(yàn)組接種5%乳酸菌混合菌劑，對(duì)照組1(空白對(duì)照)接種5%滅菌LB培養(yǎng)基空白液，對(duì)照組2接種5% MRS液體培養(yǎng)基空白液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同實(shí)驗(yàn)條件下乳酸濃度隨發(fā)酵時(shí)間變化Fig.7 Variation of lactic acid concentration with fermentation time under different experimental conditions

由圖7可知，發(fā)酵開始后6 h，實(shí)驗(yàn)組及2組對(duì)照組發(fā)酵液中乳酸含量均緩慢上升，3組乳酸含量差別不大。發(fā)酵6 h向?qū)嶒?yàn)組接種乳酸菌復(fù)合菌劑后，發(fā)酵液乳酸含量急劇上升；發(fā)酵至48 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液中乳酸含量達(dá)到最高值(20.5±0.6) g/L；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液中乳酸含量穩(wěn)定在最高值附近，略有降低。對(duì)照組1中雖然沒有外加產(chǎn)酶的芽孢桿菌及后續(xù)乳酸菌，但是餐廚垃圾利用自身的土著菌群也產(chǎn)生了一些乳酸；由于沒有外接菌種，對(duì)照組1中乳酸含量上升緩慢，發(fā)酵至72 h時(shí)，才達(dá)到最高值，僅為實(shí)驗(yàn)組在48 h時(shí)產(chǎn)乳酸量的61.1%。對(duì)照組2中雖然接種了芽孢桿菌，由于沒有接種乳酸菌劑，發(fā)酵液中乳酸生成情況與對(duì)照組1較接近，但總體含量略微高了一些。對(duì)照組2發(fā)酵至60 h時(shí)，乳酸含量即達(dá)到最高值。總體而言，餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸過程中，接種枯草芽孢桿菌和乳酸菌復(fù)合菌劑均能影響乳酸產(chǎn)量，且縮短乳酸含量達(dá)到最高值的發(fā)酵時(shí)間。篩選獲得的乳酸菌種用于餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸具有較大潛力。

3 結(jié)論

本研究從餐廚垃圾有機(jī)肥樣品中進(jìn)行乳酸菌菌種篩選，通過MRS固體培養(yǎng)基平板分離純化、菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)觀察，共獲得6株形態(tài)各異的菌株，分別編號(hào)為B1、M2、M3、M4、M5和M6。經(jīng)生理生化鑒定，所有菌株均為革蘭氏陽性菌，且均符合乳酸菌生理生化特征。

耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6株菌均具有一定的溫度、鹽度和酸堿度耐受性，但菌株M4、M5和M6的耐受性較高。綜合考慮各菌株的耐受性，確定M4、M5和M6為潛力菌株，用于后續(xù)餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸研究。經(jīng)過分子生物學(xué)鑒定，確定M4、M5和M6分別為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。抑菌性試驗(yàn)表明：菌株M4、M5和M6對(duì)枯草芽孢桿菌YB1沒有抑菌性，可制備復(fù)合菌劑。與枯草芽孢桿菌YB1混合接種用于餐廚垃圾乳酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，接種乳酸菌復(fù)合菌劑能明顯提高餐廚垃圾發(fā)酵產(chǎn)乳酸含量，與空白發(fā)酵液相比，能將乳酸產(chǎn)量提高63.6%，同時(shí)大大縮短了乳酸達(dá)到最高含量時(shí)的發(fā)酵時(shí)間。