酸凝奶豆腐產品開發及其品質評價

高磊，王超，高巖松，楊舸，趙子健，趙玉娟，牛春華，李盛鈺

(吉林省農業科學院農產品加工研究所，國家乳品加工技術研發分中心，吉林 長春，130033)

奶豆腐(Hurood)，蒙古語稱“胡乳達”，是蒙古族最具代表性的傳統發酵乳制品。奶豆腐在內蒙古錫林郭勒盟和呼倫貝爾市等地區有著悠久的制作和消費歷史。奶豆腐以牛奶、羊奶或馬奶等為原料，經自然發酵而成的傳統手工干酪產品，其傳統的制作工藝是：原料乳不殺菌，待靜置自然發酵后，收集上浮的奶油，剩下的凝乳用溫火加熱至乳清分離，再排出乳清，將凝塊高溫加熱并不斷攪動至黏稠狀后，趁熱入模成型[1-2]。奶豆腐的顏色從白色到淡黃色，營養豐富，風味獨特，是蒙古牧民家庭最常見的乳制品。

奶豆腐至今仍以原始的手工制作為主，這種簡單粗放的家庭作坊式生產，嚴重影響產品的品質和質量安全。奶豆腐的傳統制作工藝主要存在以下問題和不足：一是多種微生物參與發酵。未經殺菌的原料乳的微生物構成復雜，既有乳酸菌、酵母等有益微生物[3-4]，也有大量雜菌微生物[5]，同時一些環境中的微生物也可以通過制作器具引入，共同參與發酵；雜菌微生物的增殖和代謝，顯著影響了奶豆腐的口感、風味和質地。二是發酵時間長。奶豆腐發酵過程在夏季需要1～2 d，其他季節需要3～5 d。三是奶豆腐出品率較低。由于加工工藝沒有嚴格的參數可以借鑒，僅憑個人經驗進行操作，導致蛋白質損失較嚴重。四是多數傳統手工作坊式的制作環境，無法保障奶豆腐產品的質量和衛生。此外，也有一些研究相繼報道了通過乳酸菌輔助發酵劑、添加CaCl2、控制凝乳加熱溫度等優化了奶豆腐的加工工藝，縮短了發酵時間，提升了奶豆腐的品質[6-7]。但目前仍需要對奶豆腐的傳統加工工藝深入研究，建立標準化的操作規程和規模化生產工藝，制定產品標準，豐富產品種類。因此，本研究在奶豆腐傳統制作工藝的基礎上，采用酸凝或乳酸菌發酵代替自然發酵，改進了奶豆腐的生產工藝，開發了奶豆腐新產品，實現了傳統奶豆腐的品質升級。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳，市售；無水檸檬酸(食品級)，河南萬邦實業有限公司；DNA提取試劑盒(DNeasy PowerSoilKit)，美國Bio/QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo公司；BCN-1360B無菌超凈工作臺，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；HZQ-Q電熱恒溫培養箱，上海一恒實驗設備有限公司；Sorvall Evolotion RC高速冷凍離心機，美國Thermo公司；Freezone 6真空冷凍干燥機，美國Labconco公司；HYCV-407干酪槽，黑龍江赫益乳業科技有限公司；Testo 205 pH計，德國Testo公司；TA.XT plus物性分析儀，英國Stable Micro Systems公司；AR1500ex流變儀，美國TA儀器公司；NEXUS GRADIENT梯度PCR擴增儀，德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 乳酸菌發酵劑的制備

乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)AS185由吉林省農業科學院農產品加工研究所分離自傳統農家黃豆醬，現保藏于中國典型培養物保藏中心(M 2018114)。凍存菌株經連續傳代活化3次后，按體積分數3%接種量接種于改良M17液體培養基中，37 ℃靜置培養16 h后，離心(4 000 r/min，10 min，4 ℃)收集菌泥，并用質量分數0.85%的滅菌生理鹽水洗滌2次；向菌體中加入凍干保護劑，進行真空冷凍干燥(-80 ℃，10 Pa，20～24 h)，即獲得乳酸菌發酵劑，其活菌數達到12.28 lg CFU/g。

改良M17液體培養基(g/L)：胰蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，酵母膏2.5，磷酸甘油二鈉10.0，MgSO40.25，異抗壞血酸鈉0.5，pH為7.1～7.2，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 奶豆腐制作工藝流程

奶豆腐加工工藝如圖1所示。

圖1 奶豆腐工藝流程圖Fig.1 Flowchart of Hurood cheese processing

1.4.2 理化指標測定

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》進行脂肪含量測定，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》進行蛋白質含量測定，參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》進行水分含量測定；用Testo 205 pH計直接進行pH值測定。

1.4.3 奶豆腐凝塊微生物多樣性分析

分別取熱縮前的奶豆腐凝塊1.0 g，采用DNeasy PowerSoilKit試劑盒，按照試劑盒說明書提取微生物基因組DNA；利用16S rRNA 基因V3～V4區通用引物(338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行PCR擴增[8]，并使用質量分數2%的瓊脂糖凝膠回收PCR產物；純化后的PCR產物由上海派森諾生物科技股份有限公司利用MiSeq Reagent Kit V3 (600 cycles)進行雙端測序。

1.4.4 奶豆腐質構特性測定

取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的奶豆腐樣品，室溫放置20 min后，利用物性分析儀測定硬度、彈性、黏聚性、膠著度、咀嚼度和回復性[9]。選擇P/0.5探頭，測量前探頭下降速度1.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，測量后探頭回程速度10.0 mm/s，壓力20%，下壓變形時間10.0 s，自動觸發，觸發力2 g。

1.4.5 奶豆腐流變性質測定

將奶豆腐樣品切成直徑為20 mm，厚1 mm的圓片，利用流變儀測定彈性模量(G′)和黏性模量(G″)隨溫度和頻率的變化[10]。參數設置：選擇不銹鋼平板探頭(Φ20 mm)，平板與底盤間隙1 mm，小振幅振蕩模式；掃描頻率0.1 Hz，溫度25～80 ℃，升溫速率5 ℃/min；掃描溫度25 ℃，頻率0.1～10 Hz。

1.4.6 奶豆腐游離氨基酸測定

采用HPLC進行游離氨基酸含量的測定[11]。選擇C18 SHISEIDO色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；進樣量10 μL；流動相為0.1 mol/L無水乙酸鈉-乙腈溶液(pH=6.5)和體積分數80%的乙腈水溶液；柱溫40 ℃；檢測波長254 nm。

1.4.7 奶豆腐感官評定

參考文獻[9]和[12]，并略作修改。選取20名對色、味、質屬性敏感并具有干酪品鑒基本知識的人士組成評定小組(男∶女=1∶1)，對奶豆腐產品的顏色均勻性、光澤度、硬度、彈性、膠黏性、氣味、滋味以及加熱后拉絲性和整體可接受度進行10分制的感官評定。分數越高，代表程度越高。

1.5 數據分析

每組實驗重復3次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行差異顯著性分析，采用Canoco 4.5軟件進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，采用GraphPad Prism 7.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 奶豆腐制作工藝關鍵點分析

在奶豆腐制作中，酸化凝乳是最主要的關鍵工藝點，主要是利用酪蛋白等電點沉淀原理。

在傳統奶豆腐制作中，原料乳不經殺菌處理，而是利用原料乳本身的微生物進行室溫自然發酵產酸凝乳。但發酵時間需20 h以上，其酸度才可達到凝乳要求，即pH值達到了蛋白質等電點4.6。

在酸凝奶豆腐制作中，省去了自然發酵產酸的過程，而是利用質量分數10%檸檬酸直接將原料乳pH調節至4.6，即為直接酸化凝乳。

在乳酸菌奶豆腐制作中，先用質量分數10%檸檬酸將原料乳pH調節至5.0后，再接種產酸菌株乳酸片球菌AS185，經37 ℃、5 h發酵后酸度即可達到pH 4.6，這主要是利用了產酸菌株乳酸片球菌AS185進行適酸(pH 5.0)適溫(37 ℃)發酵產酸凝乳。

可見，不論是傳統奶豆腐的自然發酵，還是酸凝或乳酸菌奶豆腐的調酸或乳酸菌發酵，都是在pH達到4.6時終止發酵或調酸，然后再經50 ℃加熱處理，蛋白質在其等電點的熱環境下才會出現絮狀凝乳，析出乳清。但與傳統奶豆腐制作相比，酸凝或乳酸菌奶豆腐主要在發酵產酸凝乳方式上進行了改良，進而縮短了制作時間。

2.2 奶豆腐凝塊中微生物多樣性分析

通過16S rRNA高通量測序，對3種奶豆腐凝塊中的微生物群落多樣性進行了分析，酸凝或乳酸菌奶豆腐與傳統奶豆腐凝塊的微生物群在結構和組成上有很大差異(圖2)。在Chao1和Shannon多樣性指數上(圖2-a)，酸凝奶豆腐的指數最高，且顯著高于乳酸菌發酵奶豆腐(P<0.05)；門水平上(圖2-b)，傳統奶豆腐和酸凝奶豆腐主要由厚壁菌門(Firmicutese)和變形菌門(Proteobacteria)組成，相對豐度分別為65.78%和34.07%及58.96%和30.34%；乳酸菌發酵奶豆腐主要由厚壁菌門組成，相對豐度為99.21%。在屬水平上(圖2-c)，酸凝奶豆腐優勢菌群較為豐富，如乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和假單胞菌屬(Pseudomonas)；乳酸菌發酵奶豆腐優勢菌群主要為片球菌屬(Pediococcus)；傳統奶豆腐優勢菌群以鏈球菌屬(Streptococcus)和志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)為主。由此可見，前期不同的凝乳方式對凝塊中微生物多樣性影響較大，進而也會對后期產品的品質及風味產生間接影響。

a-多樣性指數；b-物種組成相對豐度(門水平)；c-物種組成熱圖(屬水平)圖2 奶豆腐凝塊微生物的多樣性Fig.2 Microbial diversity in curd of Hurood cheese

2.3 基本理化指標分析

3種不同工藝制作的奶豆腐在脂肪、蛋白質、水分含量及pH值等理化指標差異較大(表1)。

表1 奶豆腐的基本理化指標Table 1 Physicochemical composition of Hurood cheese

由表1可以看出，傳統豆腐的脂肪含量明顯低于其他2種奶豆腐，蛋白質含量較高，pH值較低；而酸凝奶豆腐和乳酸菌發酵奶豆腐的脂肪、蛋白質含量和pH值接近；3種奶豆腐水分含量無差異。說明凝乳方式不同對產品的脂肪和蛋白質含量有較大影響。

2.4 質構特性分析

利用物性分析儀對3種奶豆腐的硬度、彈性、黏聚性、膠著度、咀嚼度和回復性進行了測定(圖3)。由圖3可以看出，酸凝或乳酸菌奶豆腐的硬度、膠著度和咀嚼度顯著低于傳統奶豆腐，存在顯著性差異(P<0.01)，酸凝奶豆腐的硬度、膠著度和咀嚼度均為最低。在彈性、黏聚性、回復性方面，3種奶豆腐之間的差異不顯著(P>0.05)。說明經自然發酵后的傳統奶豆腐的硬度高，膠著度高，咀嚼度高，口感差；而經酸凝后，由于酪蛋白凝乳沉淀較好，會使得奶豆腐的硬度和膠著度降低、更易咀嚼。

a-硬度；b-彈性；c-黏聚性；d-膠著度；e-咀嚼度；f-回復性圖3 奶豆腐的質構特性Fig.3 Texture characteristics of Hurood cheese注：*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)

2.5 流變學特性分析

采用流變儀對3種奶豆腐進行了彈性模量(G′)和黏性模量(G″)的測試(圖4)。從振動頻率掃描結果(圖4-a)可知，3種奶豆腐的G′>G″，均隨振動頻率的增加而升高，且酸凝或乳酸菌奶豆腐的黏彈性模量值低于傳統奶豆腐。由此說明，酸凝或乳酸菌奶豆腐的蛋白水解程度高，質地柔軟，這也與酸凝或乳酸菌奶豆腐中游離氨基酸含量高、硬度低和膠著度低的結果一致。從溫度掃描結果(圖4-b)可知，隨溫度的升高，3種奶豆腐各自的G′和G″變化均呈下降趨勢；在開始升溫階段，均是G′>G″；當溫度達到65 ℃時，傳統奶豆腐的G′和G″值出現了近似相等，但G′>G″，仍為固態；當溫度達到73 ℃時，酸凝或乳酸菌奶豆腐的G′和G″出現了相等，隨后G′略低于G″，即由固態開始轉向液態，說明酸凝或乳酸菌奶豆腐經73 ℃加熱后開始處于熔融狀態。由此說明，酸凝或乳酸菌奶豆腐的熔化溫度要高于傳統奶豆腐，且達到一定溫度時，其熔化性和流淌性較好。

a-振動頻率掃描；b-溫度掃描圖4 奶豆腐的流變學特性Fig.4 Rheological properties of Hurood cheese

2.6 游離氨基酸含量分析

對這3種奶豆腐進行了17種游離氨基酸分析(表2)，發現3種奶豆腐氨基酸的數量和含量均有顯著差異(P<0.05)。由表2可以看出，與傳統奶豆腐相比，酸凝或乳酸菌奶豆腐中缺少了組氨酸，乳酸菌奶豆腐中還缺少蘇氨酸，3種奶豆腐中游離氨基酸數量分別是15、14、13種；傳統奶豆腐中苯丙氨酸、異亮氨酸、賴氨酸含量居高，酸凝或乳酸菌奶豆腐中苯丙氨酸、谷氨酸、丙氨酸含量居高；但就氨基酸總量而言，酸凝奶豆腐的氨基酸總量最高，存在顯著性差異(P<0.05)，傳統奶豆腐與乳酸菌奶豆腐之間無顯著差異(P>0.05)。由此說明，傳統奶豆腐與酸凝或乳酸菌奶豆腐的生產工藝、微生物種類及其產生的蛋白酶存在差異，蛋白質水解或者肽鏈斷裂方式不同產生的氨基酸種類和含量不同，這也顯著影響奶豆腐的風味和質地。

表2 奶豆腐中游離氨基酸含量 單位：mg/kg

2.7 感官評定

對3種奶豆腐的感官屬性進行了綜合評定(圖5)。由圖5可以看出，酸凝或乳酸菌奶豆腐的感官得分均高于傳統奶豆腐，尤其是在光澤度、硬度、滋味、加熱后的拉絲性和整體可接受度方面。此外，感官評定綜合發現，傳統奶豆腐外觀質地較松散，口味偏酸，入口質地粗糙；酸凝或乳酸菌奶豆腐品質細膩，酸度適中，口感細膩，加熱后拉絲性好。

圖5 奶豆腐的感官評分Fig.5 Sensory score of Hurood cheese

2.8 冗余分析

對3種奶豆腐的基本理化指標(脂肪、蛋白質、水分、pH)、具有差異顯著的質構參數(硬度、膠著度、咀嚼度、回復性)及含量較高的游離氨基酸(谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸)進行了冗余分析，結果如圖6所示。RDA1和RDA2的總方差分別為77.15%和6.34%。酸凝發酵對奶豆腐中的丙氨酸(Ala)和精氨酸(Arg)產生了主要影響；乳酸菌發酵影響了奶豆腐的脂肪(Fat)含量和pH值及其苯丙氨酸(Phe)和谷氨酸(Glu)的產生；自然發酵則對奶豆腐的蛋白質(Pro)、異亮氨(Ile)、水分(Moisture)含量及硬度(Harthness)、膠著度(Conglutination)、咀嚼度(Chewiness)和回復性(Restorative)產生了重要影響。同時也可發現，奶豆腐產品的質構特性受凝乳方式影響較大。

圖6 冗余分析Fig.6 RDA analysis

3 討論

未經殺菌原料乳的質量在奶豆腐生產過程中起重要作用。特別是原料乳中復雜的天然菌群直接參與奶豆腐的發酵，會顯著影響奶豆腐的品質。原料乳中存在的微生物，一類是有助于發酵凝乳和提升奶豆腐品質的有益微生物，如乳桿菌、乳球菌、腸膜明串珠菌和酵母菌等，許多研究人員已經成功地從傳統的自然發酵干酪制品中分離和鑒定了一些益生菌[13-14]；另一類則是對產品品質產生不利影響的雜菌。因此，奶豆腐加工過程中對雜菌的控制顯得尤為重要。本研究正是基于上述考慮，采用酸凝、調酸結合乳酸菌發酵代替傳統的自然發酵方式，通過調酸和縮短發酵時間抑制雜菌微生物的生長，促進乳酸菌等耐酸有益微生物的生長，來控制奶豆腐制作過程。研究結果表明，獲得的酸凝或乳酸菌奶豆腐的品質優于傳統自然發酵奶豆腐。一些研究也報道了乳酸菌作為附屬發酵劑用于傳統干酪加工，改善了干酪口感風味，提升了干酪品質[15-16]。另外，很多干酪的加工原料乳也不殺菌，例如哈羅米(Halloumi)干酪，但其凝乳后的凝塊需經高溫蒸煮處理，即達到殺菌目的，原料乳不殺菌有助于干酪質構和風味的形成[17-18]。我們也嘗試將原料乳巴氏殺菌后，接種乳酸菌發酵劑，控溫發酵改良傳統奶豆腐工藝，但生產的奶豆腐品質不如傳統奶豆腐，這說明原料乳中的微生物、活性酶等顯著影響奶豆腐的口感、風味和質構。

我國的傳統干酪大多是酸凝干酪，依靠原料乳和加工環境引入產酸微生物，主要是乳酸菌發酵產酸凝乳，如奶豆腐、奶干、曲拉、奶疙瘩等。也有利用木瓜等原料制取酸水加熱凝乳生產的乳扇等。近年來，一些研究報道了采用檸檬酸、乳酸、醋酸等有機酸直接調酸凝乳生產酸凝干酪，優化了產品的加工工藝，豐富了干酪產品種類[19-20]，也有研究對比了酸凝和酶凝法加工干酪的出品率、感官品質和蛋白降解等[21-22]。

本研究采用直接酸化凝乳和調酸結合乳酸菌發酵凝乳兩種方法開發了2款新型奶豆腐產品，新產品在流變特性、質構、游離氨基酸、感官和微生物多樣性等方面均優于傳統工藝奶豆腐。本研究結果進一步說明了酸凝法生產有其獨特的技術優勢，例如工藝簡單、成本低廉、產品口感風味易于接受等。本研究也發現，直接酸化凝乳生產的奶豆腐品質優于先調酸再乳酸菌發酵凝乳法，這可能是因為凝乳后凝塊中微生物多樣性不同所致。直接酸化法是在開放的環境下將原料乳pH值迅速下降至4.6時進行凝乳，致使凝塊中的微生物多樣性較為豐富；而先調酸再進行乳酸菌發酵凝乳，在其緩和的發酵過程，乳酸菌種的不斷產酸，成為優勢菌，將會抑制其他微生物的生長。由此也進一步說明，在奶豆腐制作過程中，微生物環境對奶豆腐產品的品質有較大相關性。

4 結論

本研究遵循奶豆腐的傳統制作工藝，采用酸凝或乳酸菌發酵代替自然發酵，縮短了奶豆腐的發酵時間，有效控制了有害微生物，提升了奶豆腐的品質。其中，酸凝奶豆腐的生產工藝簡單，口感、風味等顯著優于傳統奶豆腐，可作為新型奶豆腐在牧區進行推廣應用，不但可提升奶豆腐生產效率，節約成本還有利于促進牧民增收。