基于圖像計數釀酒酵母的統計分析

李雪松，陳翔宇，李蒙蒙，徐娟，林麗軍，陸利霞，崔曉文，熊曉輝

(南京工業大學 食品與輕工學院，南京，211800)

傳統的平板計數法是國際公認的權威微生物計數。但是平板計數培養時間長，有時具有滯后性[1]，其次平板計數法僅計數可培養的活菌，對于不可培養的微生物無法進行檢測[2]。目前已有許多新型的微生物計數方法，如還原顯色法、阻抗法、ATP生物發光法、熒光儀法、電化學發光法等[3-7]。這些方法間接、快速獲知菌體數量，但極易受環境及基質影響。對菌體逐個計數的直接計數方法更快速、準確，如流式細胞儀可對高速流動的微生物個體逐個檢測，且可對死、活菌分別計數[8]。目前流式細胞儀已經應用于微生物的檢測[9-11]，但流式細胞儀價格昂貴,檢測成本高。

基于微生物圖像計數的方法是另一種成本更低的直接計數方法，其原理是顯微鏡鏡檢技術，計數載體通常為具有固定微體積的計數板或具有固定面積的濾膜。而根據載體的不同，圖像計數定量微生物濃度的統計方法也有所不同。血球計數板使用最多，其計數室深度為0.1 mm，容積為0.1 μL，可計數真菌及一些形態較大的細菌[12]。而濾膜法是將試樣中的微生物細胞過濾在濾膜上，在顯微鏡下計數一定面積濾膜上的細胞數量，進而推算出樣品中微生物的濃度[13-14]。因此在圖像計數中，定量結果都是基于部分體積或面積中細胞數量推算的結果。結果的準確推算基于2個假設：微生物細胞的分布是均勻的；對部分體積或面積中微生物統計的參數可以代表總體[15]。然而現有的研究中很少對以上的假設進行分析和說明，且目前圖像計數沒有統一的分析方法。其次，關于圖像計數和平板計數的結果間的比較未見報道。

本研究使用具有固定體積的微型計數板，將不同濃度的釀酒酵母樣品經美蘭染色后加入微型計數室中，智能手機獲取菌體的顯微圖像，并對圖像中的活菌進行計數。本研究對圖像計數過程進行了廣泛的統計學分析，并與GB 4789.15—2016中的平板計數法進行了對比，以期為微生物圖像計數的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ATCC 9080，本實驗室保存；0.01 mol/L PBS(pH 7.45)，0.1%堿性美蘭染色液，上海生物工程有限公司；酵母浸出粉葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基，青島海博生物技術有限公司。所有的試劑與培養基均用超純水配制。

1.2 儀器與設備

自制微型計數板，聚甲基丙烯酸甲酯制作，計數室規格24 mm×4.15 mm×0.1 mm；BM1000生物顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；Redmi k40智能手機，北京小米科技有限責任公司；SHP-100智能生化培養箱，上海三發科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 釀酒酵母菌液的制備

將保存的釀酒酵母接種于YPD培養基中，37 ℃恒溫振蕩培養12 h，連續活化2～3次。取37 ℃下培養18 h的菌液1 mL于1.5 mL離心管中1 500 r/min離心5 min，去上清液，菌泥用同體積的無菌PBS重懸，以10倍稀釋制得不同濃度的樣品液，備用。

1.3.2 釀酒酵母顯微圖像的獲得及菌體計數

1.3.2.1 釀酒酵母美蘭染色

取100 μL釀酒酵母懸液，渦旋分散，加入100 μL美蘭染色液，室溫染色3 min，吸取染色后的菌液，加入并充滿微型計數室。未染色的為活酵母細胞，藍色的為死亡酵母細胞。

1.3.2.2 釀酒酵母計數用顯微圖像獲得

所使用顯微鏡物鏡40倍，目鏡10倍，圖像總放大倍數為400倍，單個顯微鏡視野的直徑為0.45 mm。通過智能手機獲得顯微鏡圖像，每個圖像對應一個完整的視野，用于釀酒酵母圖像計數。通過智能手機從每個微型計數室獲得均勻分布、不重疊、用于定量計數的200個圖像。

1.3.2.3 圖像中釀酒酵母的計數

使用Image J[16]軟件對獲得的圖像進行酵母菌計數，分別計數每張圖像中的活菌數量和死菌數量，每個圖像中活菌數量計為yi。

1.3.3 釀酒酵母濃度平板計數

依據GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》對釀酒酵母濃度進行平板計數。

1.3.4 圖像計數統計分析

使用1.3.1制備的不同濃度釀酒酵母樣品，對每個樣品進行13、25、50、100、200個圖像的采集，并計數每個圖像中釀酒酵母數量。對計數結果進行統計學分析[17]，每個樣品重復3次。

1.3.4.1 箱線圖的制作

制作不同圖像中釀酒酵母數量的箱線圖，圖中大于Q3+1.5IQR和小于Q1-1.5IQR的數量值判斷為異常值，其中Q1為下四分數，Q3為上分位數，四分位間距IQR=Q3-Q1。圖像中釀酒酵母數量平均值的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：n, 計數的圖像數量；yi, 每個圖像中活菌數量。

1.3.4.2 統計參數的分析

1.3.4.3 圖像計數定量樣品中釀酒酵母濃度的計算

(2)

式中：n,計數的圖像數量；V,單個圖像體積，0.016 μL；2,樣品加入等體積美蘭染色液的稀釋系數。

1.3.5 圖像計數與平板計數結果的不確定度

對于圖像計數和平板計數過程，都是通過對不同視野圖像或平行平板重復計數計算得到最終定量結果。因此在重復計數過程中，不同圖像或平板中菌體或菌落數量的差異性會造成定量結果的不確定，根據JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》的規定計算不確定度。不確定度也反映了對應分析過程的誤差水平[18]。

1.3.5.1 圖像計數結果不確定度的計算

以單個圖像計數定量樣品中釀酒酵母濃度如公式(3)所示：

(3)

基于單個圖像計數定量結果的標準不確定度(以標準偏差表示)的計算如公式(4)所示：

(4)

相對標準不確定度的計算如公式(5)所示：

(5)

最終對樣品的定量結果是對n個圖像計數結果的平均值。因此，最終圖像計數定量結果的標準不確定度按公式(6)計算，相對標準不確定度按公式(7)計算：

(6)

(7)

根據不確定度計算了定量結果的95%置信區間，如公式(8)所示：

(8)

式中：t0.025臨界值由自由度為n-1的學生氏t分布確定。

1.3.5.2 平板計數結果不確定度的計算

平板計數方法按GB 4789.15—2016所規定的操作執行，但對連續2個稀釋梯度，每個稀釋梯度均傾注了50個平板。對100個平板進行釀酒酵母菌落計數，每個平板中菌落數標記為XAi，XBi。

基于單個平板計數結果的標準不確定度(以標準偏差表示)的計算如公式(9)(10)所示。相對標準不確定度如公式(11)所示：

(9)

(10)

(11)

式中：A,第一稀釋梯度；B,第二稀釋梯度；i,每個稀釋梯度中的平行平板，i=1，2，3，…50。根據國標方法的要求，選擇2個稀釋梯度的菌落數在10～150個之間的平板為有效平板，有效平板數量記為m。Xi,有效平板中的菌落數，對于第一稀釋梯度Xi=XAi，對于第二稀釋梯度Xi=0.1XBi。

在GB 4789.15—2016平板計數中連續2個稀釋梯度各傾注2塊平板，因此平板計數的結果由4塊平板得出，故n取4。得到平板計數結果的標準不確定度的計算如公式(12)所示，相對標準不確定度計算如公式(13)所示：

(12)

(13)

1.4 數據統計與分析

使用SPSS 22.0軟件和Origin 2018軟件對實驗數據進行統計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度釀酒酵母樣品圖像中菌體數量分布

選取了105～107CFU/mL濃度范圍內的5個樣品，濃度由高至低標記為A～E。各樣品圖像中釀酒酵母的數量如圖1所示(圖1-a～1-e對應樣品A～E；Ⅰ～Ⅲ表示每一樣品的3次重復圖像計數)，箱體線段至上而下依次表示最大值、上四分位數、中位數、下四分位數和最小值，箱體內散點為平均數，箱體外為異常值。由圖1可知，釀酒酵母數量在不同圖像中存在很大的差異。如樣品A，單個圖像中釀酒酵母計數結果最多為449個，最少為151個。并且樣品濃度為105CFU/mL，不同圖像中釀酒酵母數量差異更大，如樣品E的圖像中釀酒酵母數量最多為11個，單個圖像中出現無菌體的現象。每個樣品中部分組別的箱線圖中可觀察到異常值，如樣品A的重復2(圖1-a-Ⅱ)，圖像數量為200時，存在異常值449、201；樣品B的重復1(圖1-b-Ⅰ)，圖像數量為25時，存在異常值104。表明溶液中細胞分布不均勻，從而導致定量結果的不確定。

對樣品A、B、C不同重復的箱線圖進行分析。發現在不同計數圖像數量時，平均數均屬于同一水平，且與中位數基本重合；隨計數圖像數量的變化，數據的分布范圍存在差異，但箱體寬度基本一致，表明數據具有相似的集中程度。分析樣品D、E不同重復的箱線圖，隨著計數圖像數量增加到50個時，平均數逐漸達到同一水平，并接近于中位數；此時箱線圖數據的分布范圍與箱體的寬度也趨于一致，表明不同數據組之間具有相似的分布特點。對5個樣品，3個重復，不同計數圖像數量下得到的共75組數據進行正態分布檢驗(Shapiro-Wilk Test,P>0.05)，顯示僅有40組數據通過檢驗。

在一些基于顯微圖像計數的微生物計數方法中，一定區域中微生物的分布常被建模為泊松分布[19]或正態分布[20]。本研究中基于箱線圖的形狀，在不同的圖像中釀酒酵母的數量成對稱分布，不同計數圖像數量的箱線圖也說明對分布方式的準確判斷需要足夠數量的圖像。

2.2 計數圖像數量對釀酒酵母計數結果的影響

2.2.1 計數圖像數量對釀酒酵母計數中位數的影響

在統計學中，中位數受極端數據的影響較小，是反映一組數據特征的重要參數[17]。不同計數圖像數量時釀酒酵母計數的中位數及變化趨勢見圖2。對于106～107CFU/mL濃度的樣品A、B、C，當計數圖像的數量由13個增加至200個時，中位數依次為樣品A(299.50～301.67)，樣品B(69.50～70.67)，樣品C(27.33～28.00)(圖2-a)，且其變化均小于5%，見圖2-b。而對于105CFU/mL濃度的樣品D、E，隨統計圖像數量的增加，釀酒酵母計數的中位數逐漸趨于穩定，當數量達到50個以上時,樣品D中位數趨于7，樣品E中位數為2；此時中位數數值變化小于10%(圖2-b)。結果表明，計數一定數量的圖像后，計數中位數可以代表總體的數量特征，可作為圖像計數統計分析的參數。釀酒酵母濃度為106～107CFU/mL時，需計數的圖像數量為13個；釀酒酵母濃度為105CFU/mL時，需計數的圖像數量為50個。

a-3.5×107 CFU/mL；b-7.3×106 CFU/mL；c-3.5×106 CFU/mL；d-7.5×105 CFU/mL，e-2.7×105 CFU/mL圖1 不同統計圖像數量中釀酒酵母數量箱線圖Fig.1 Box diagram of the cell number of S.cerevisiae by different image amounts

a-不同計數圖像數量時中位數；b-不同圖像數量中位數與200個圖像計數中位數的百分比圖2 釀酒酵母計數中位數隨計數圖像數量的變化(n=3)Fig.2 Median change of S.cerevisiae by the different image amounts(n=3)

2.2.2 計數圖像數量對釀酒酵母計數平均數的影響

計數不同數量的圖像后得到的圖像中釀酒酵母數量的平均數及百分比變化趨勢見圖3。樣品A、B、C圖像計數的平均數均大于20個(圖3-a)，計數平均數隨圖像數量變化小于5%(圖3-b)，13個圖像計數平均數即穩定。

a-圖像中釀酒酵母數量的平均數；b-不同圖像數量計數平均數與200個圖像計數平均數的百分比圖3 釀酒酵母計數平均數隨計數圖像數量的變化(n=3)Fig.3 Average change of S.cerevisiae by the different image amounts(n=3)

對于樣品D、E，圖像計數的平均數小于10個，當計數圖像數量為13和25時，釀酒酵母計數平均數差異大；當圖像數量達到50個時，平均數隨圖像數量變化小于5%(圖3-b)。分析表明，對一定數量的圖像計數后得到的計數平均數可反映總體的數量特征，可作為圖像計數統計分析的參數。在本研究中，釀酒酵母濃度為106～107CFU/mL時需統計圖像數量至少為13個，濃度為105CFU/mL時需統計圖像數量至少為50個，所得平均數更反映實際細胞數量。

2.2.3 不同圖像間釀酒酵母數量的相對標準偏差隨計數圖像數量的變化

相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為反映不同圖像中釀酒酵母數量的差異性的統計學參數，也用于計算圖像計數結果的不確定度。如圖4-a，不論計數圖像數量為多少，均存在RSDA

a-不同計數圖像數量時釀酒酵母數量的RSD；b-不同圖像數量下RSD與200個圖像下所得RSD的百分比圖4 釀酒酵母數量的RSD隨計數圖像數量的變化(n=3)Fig.4 RSD change of S.cerevisiae by the different image amounts(n=3)

2.3 圖像計數與平板計數的對比

2.3.1 圖像計數與平板計數結果的不確定度

由表1可知，釀酒酵母平板計數的相對標準不確定度為0.099，95%置信區間下限為26.3，上限為29.4。

表1 平板計數統計結果Table 1 Statistical results by plate counting

表2 圖像計數統計結果Table 2 Statistical results by image counting

計數的視野數量和視野中目標物的數量決定了計數誤差或精密度水平[21]。如在我國水利部SL 733—2016《內陸水域浮游植物監測技術規范》中規定每個視野的浮游植物平均數須對應相應的計數視野數。美國標準《Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater(22nd)》對水中藻類的計數中要求在濾膜的每個視野中存在10～20個自然單位。本研究也證明了增加統計的圖像數量可以有效提高圖像計數的精確度。而伴隨著數字圖像處理技術的廣泛研究與應用，對超大量圖像實現自動分析變得簡單[22]。因此圖像計數有望得到更精確的定量結果。其次，本研究中計算的不確定度僅是指2種計數過程中由于重復計數所帶來的不確定度，而并非總的不確定度。但研究表明，重復的平板計數給計數結果的不確定度帶來了最大的貢獻[23]。而KIRCHMAN等[24]使用顯微鏡計數細菌的研究也表明，不同視野計數的變異是計數結果總變異的最大來源，占總變異的60%～80%。

2.3.2 兩種計數結果的比較

對105～107CFU/mL釀酒酵母樣品分別通過平板計數和圖像計數進行定量分析，釀酒酵母樣品濃度進行對數轉換，結果見表3。采用雙尾配對t檢驗對2種定量計數結果進行分析，表明圖像計數結果顯著大于平板計數結果(P<0.05)。并且圖像計數結果的變異系數均在10%以下，小于平板計數，可重現性更好。

表3 平板計數和圖像計數得到的釀酒酵母樣品濃度Table 3 Cell concentration of S.cerevisiae by plate counting and image counting

對2種結果進行線性回歸分析，結果如圖5所示。線性回歸結果表明，在105～107CFU/mL時，釀酒酵母樣品采用圖像計數與平板計數存在顯著的相關性(P<0.001，R2=0.999 6)。2種定量結果盡管在統計學上存在顯著差異，但對其差值進行比較，在試驗的所有樣品中，圖像計數與平板計數定量樣品濃度的對數值相差均小于0.1，所計數的樣品中釀酒酵母濃度相差均未出現數量級上的差異。表3表明，圖像計數結果的變異系數均小于平板計數結果的變異系數，也說明了圖像計數變化較小。依據中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心微生物定量(如食品中菌落總數)能力驗證(實驗室間，參與者)結果判斷，能力驗證評價標準按照|Z|值進行評價，|Z|<2.0為滿意結果[25]。釀酒酵母濃度為105～107CFU/mL范圍內，圖像計數結果與平板計數結果一致，且前者精確度與重復性更好。

圖5 兩種定量結果的線性關系Fig.5 The linear relationship between the results of two quantitative analyses

3 結論

本研究以105～107CFU/mL的釀酒酵母為分析對象，表明需一定數量的圖像計數可以得到總體的數量特征，計數平均數和中位數可作為圖像計數統計分析的參數。在本研究對釀酒酵母樣品的圖像計數中，釀酒酵母濃度為106～107CFU/mL時需統計圖像數量至少為13個，濃度為105CFU/mL時需統計圖像數量至少為50個，圖像計數方法不確定度較小，并且通過增加計數圖像的數量可以進一步減小結果的不確定度，使結果更加精確。對釀酒酵母樣品圖像計數和平板計數比較表明，在105～107CFU/mL時，釀酒酵母樣品采用圖像計數與平板計數存在顯著的相關性，2種計數結果的對數值相差均小于0.1，圖像計數結果的變異系數均小于平板計數結果的變異系數。

目前隨著微流控技術與數字圖像處理技術的快速發展，圖像計數呈現出動態化、自動化的特點，使得基于圖像計數的微生物計數方法具有了更大的發展空間[26-27]。本研究的成果為新型圖像計數方法的開發與使用提供了統計分析依據。