熱誘導大豆分離蛋白聚集對谷氨酰胺轉氨酶交聯乳液凝膠性質的影響

孟少華，馬相杰，趙建生，卜曉彤，李鑫，袁靜瑤，楊鈺菲，鄒神中，傅禮瑋，曾茂茂，陳潔

1(河南雙匯投資發展股份有限公司，河南 漯河，462000)2(河南省肉品技術創新中心有限公司，河南 漯河，462000) 3(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 4(江南大學 國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫，214122)

乳液凝膠，是一種同時具有乳液結構和凝膠網絡結構的軟固體材料，具有獨特的三維網狀結構，可以將乳化油滴固定在凝膠網絡結構中[1-2]。許多食品體系如豆腐、肉制品、奶酪和酸奶等都可以歸類于乳液凝膠，乳液凝膠在食品加工中得到了廣泛的應用。蛋白質是人類必需的營養物質，同時還具有多種功能特性，如凝膠性和乳化性，因此在乳液及凝膠體系中被廣泛研究。隨著消費者對健康、可持續生產越來越重視，植物蛋白在近年來成為研究的熱點。并且，目前許多研究都強調了飲食中增加豆類的積極影響[3-5]。

為了獲得具有更好性能的凝膠產品，采用微生物來源的谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase，TGase)交聯是一種有效且綠色的蛋白質凝膠改善方法[6-7]。TGase可以催化蛋白質中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基和賴氨酸殘基的ε-氨基之間的?；D移反應，從而導致分子間或分子內交聯[8]。TGase誘導的蛋白凝膠性質受大豆品種、蛋白質組成、鹽濃度和熱處理的影響[9-11]。其中大豆蛋白質的熱變性是重要影響因素，熱處理可以改變蛋白質的結構，改變其功能特性，通過預熱獲得的蛋白質聚集體具有更高的持水能力[12]。WANG等[13]發現較大的大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)聚集體對凝膠性能有積極作用，凝膠彈性模量顯著增加。大豆蛋白的聚集狀態可能是影響蛋白凝膠系統性能的重要因素。然而，在商品化SPI生產過程中，不可避免地會發生一定程度的熱變性和聚集[14]。因此，對于實際加工和應用來說，了解大豆蛋白聚集體對TGase交聯乳液凝膠性能的影響是必要的。然而，TGase誘導大豆蛋白交聯的研究主要集中在天然蛋白上，熱誘導的大豆蛋白聚集體對TGase交聯乳液凝膠的影響尚未見報道。

為了解不同SPI聚集體的乳化性質以及對后續TGase交聯凝膠行為的影響，本文考察了不同熱變性程度的SPI對TGase交聯形成的蛋白乳液凝膠性質的影響。此外，從不同蛋白含量及油含量的角度，探討其與TGase交聯的乳液凝膠的各種性質之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

臺灣292大豆，黑龍江慶美種業有限公司；TGase(酶活力90 U/g)，購于江蘇泰興市東圣生物科技有限公司；大豆油，上海益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；無水乙醇、正己烷、鹽酸、NaOH(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

9FZ-15B粉碎機，臺州余國電器有限公司；DELTA320 pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GL-10MD冷凍離心機，湖南湘儀儀器公司；TA-XT Plus質構儀，英國Stable Micro System公司；ZPH-300相稱顯微鏡，上海宙山精密光學儀器有限公司；HAAKE MARSⅢ流變儀，德國Thermo Scientific公司；Ultra-Turrax T18 basic高速均質器，德國IKA公司；LUMiSizer651全功能穩定性分析儀，德國LUM公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同熱處理的SPI聚集體的制備

大豆經過去皮、粉碎、脫脂處理后，將脫酯豆粉與水按照料液比1∶10 (g∶mL)混合，隨后用2 mol/L的NaOH溶液調節pH至8.0，在室溫條件下攪拌1.5 h。將分散體系進行離心(6 500 r/min，25 min，4 ℃)以分離出上清液。通過滴加2 mol/L的鹽酸調節pH至4.5，在室溫條件下攪拌1 h后通過離心(3 500 r/min，15 min，4 ℃)分離出沉淀。將沉淀與水以料液比1∶6 (g∶mL)進行復溶并調節pH至7.0，冷凍干燥，得到天然SPI(蛋白得率64.9%，蛋白含量85.5%，水分3.5%，脂肪0.3%，灰分4.6%)，將樣品研磨成粉末并真空包裝，置于-80 ℃冰箱存放。

將天然SPI溶液(蛋白質量分數為6.1%)在不同溫度下(65、85、95 ℃)水浴加熱10 min，收集不同熱變性程度的蛋白質聚集體及未加熱的天然蛋白進行冷凍干燥，將其分別命名為65 ℃-SPI、85 ℃-SPI、95 ℃-SPI、Native-SPI。

1.3.2 蛋白乳液的制備

1.3.2.1 不同熱處理SPI制備的乳液

將15% (質量分數)不同溫度熱處理的SPI樣品充分溶解，SPI溶液與大豆油以質量比4∶1混合，并使用高速均質器在13 500 r/min下均質5 min，從而得到蛋白質量分數為12%的蛋白乳液。

1.3.2.2 不同蛋白濃度制備的乳液

將95 ℃-SPI樣品按照10%、12.5%、15% (質量分數)分別進行充分溶解，將SPI溶液與大豆油以質量比4∶1混合，并使用高速均質器在13 500 r/min下均質5 min，從而得到蛋白質量分數分別為8%、10%、12%的蛋白乳液。

1.3.2.3 不同油濃度制備的SPI乳液

將95 ℃-SPI樣品按照12.6%、13.3%、14.1%、15% (質量分數)進行充分溶解，將SPI溶液與大豆油以19∶1、9∶1、17∶3、4∶1(質量比)的比例混合，并使用高速均質器在13 500 r/min下均質5 min，從而得到油質量分數分別為5%、10%、15%、20%的蛋白乳液，不同油濃度乳液的蛋白質量分數為12%。

1.3.3 蛋白乳液凝膠的制備

將配制好的乳液，在4 ℃下保藏30 min，添加1%(質量分數，按照蛋白干基質量計)的TGase，攪拌均勻，在50 ℃下培養1 h，隨后在75 ℃下加熱15 min以達到滅酶的目的，滅酶結束后立即冰浴冷卻，4 ℃冷藏過夜后脫模，以用于后續分析表征。

1.3.4 乳化性(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩定性(end system identifier，ESI)的測定

將不同熱處理的大豆蛋白溶液(10 g/L)與大豆油以4∶1的體積比混合，然后使用高速均質機在10 000 r/min下均質2 min。取出20 μL乳液加入到5 mL質量分數0.1%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液中振蕩均勻，隨后立即用紫外分光光度計測定其在500 nm處的吸光度A0。將上述制備的乳液在室溫下保持30 min后，如上述方法，在500 nm處測定吸光度A30，取SDS溶液作為空白對照。EAI和ESI按公式(1)、(2)計算：

(1)

(2)

式中：T，濁度，為2.303；N，稀釋倍數，為250；c，蛋白濃度；θ，油的體積分數。

1.3.5 乳液穩定性的測定

通過穩定性分析儀表征不同溫度熱變性SPI制備蛋白乳液的穩定性，參照CAI等[15]的方法，并稍作修改，離心轉速設定為4 000 r/min，輪廓線560張，截圖時間間隔為15 s，光因子設定為1.0，測試溫度25 ℃，測試光源470 nm，測試總時長140 min。通過儀器自帶軟件對澄清指數進行計算。

1.3.6 乳液凝膠質構性能的測定

利用質構儀測定乳液凝膠的質構特性，樣品的直徑為29 mm，高度為30 mm。所用探頭為P/50，測前速度2 mm/s，測定速度1 mm/s，測后速度5 mm/s，觸發力為10 g，測定距離設定為凝膠50%應變，測得凝膠的硬度、彈性、咀嚼性等。

1.3.7 蛋白凝膠微觀結構的表征

取蛋白凝膠中間位置切片，將凝膠片放在載玻片上用光學顯微鏡放大100倍觀察并拍照。

1.3.8 乳液黏度的測定

利用流變儀測定乳液的表觀黏度，在25 ℃下，剪切速率設置為0.01～100 s-1，間隙為1 mm，35 mm錐板進行旋轉剪切，對乳液的表觀黏度進行表征。

1.3.9 蛋白乳液凝膠持水性的測定

參照周士琪[16]的方法稍作修改，將新鮮制備的5 g乳液凝膠樣品4 ℃放置24 h，取出恢復至室溫，稱質量(m1)后放入干燥的離心管中，4 ℃、7 000 r/min離心20 min，將乳液凝膠取出，吸取表面水分后再次稱質量(m2)，持水性按公式(3)計算：

(3)

1.3.10 蛋白乳液凝膠持油性的測定

參照周士琪[16]的方法并稍作修改，新鮮制備的5 g乳液凝膠樣品4 ℃放置24 h，將乳液凝膠稱質量(m1)后放入預先稱質量的離心管(m2)中，再于70 ℃水浴30 min，4 ℃、7 000 r/min離心20 min。離心完成后將乳液凝膠取出，隨后將離心管于65 ℃下烘干至恒重，對烘干后的離心管進行稱質量(m3)，離心管增加質量即為油脂損失，持油性按公式(4)計算：

(4)

1.3.11 數據分析

所有實驗均重復3次，結果表示為平均值±標準偏差。采用Origin 2022軟件進行作圖。采用SPSS 19.0分析其顯著性差異以及相關性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 熱處理溫度對SPI乳化性能的影響

2.1.1 EAI及ESI性能

如圖1所示，經過熱變性后有效地改善了SPI的乳化性能。相較于Native-SPI，經過熱處理后SPI的EAI和ESI顯著增加。這是由于熱處理誘導蛋白質的去折疊，并使得蛋白質內部的疏水基團暴露，在之前的研究中發現，隨著熱處理溫度的增加，SPI的疏水性顯著增加[17-18]。從而改變了蛋白分子表面的親水/親油性，增強其在油/水界面上的吸附能力和乳液的黏度，導致其乳化活性和乳化穩定性的增強。GUO等[19]發現熱處理也會導致蕓豆蛋白疏水性的增加，其穩定乳液的ESI和EAI顯著增加。

a-ESI；b-EAI圖1 經不同加熱處理SPI的ESI和EAIFig.1 ESI and EAI of SPI subjected to different heat treatment注：小寫字母不同表示樣品間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 乳液穩定性

如圖2所示，在測量之前，乳液被均勻化，幾乎沒有光線通過樣品。離心后，在離心力的作用下，乳液體系不穩定會導致蛋白質沉淀于樣品池底部，導致透光率的降低，同時會導致部分水相的析出，使得樣品池中部區域透光率增加，而較輕且不太透明的油相會上升到頂部，形成奶油層。隨著對SPI熱處理溫度的增加，離心結束后，最終的樣品輪廓線較初始狀態呈現越來越小的趨勢。Native-SPI制備的乳液其穩定性輪廓圖變化最為明顯，隨著離心的進行，樣品池中的透光率逐漸增大，在測定結束后，樣品池中部的透光率均已接近20%，說明乳液中有水相析出，此時乳液的澄清指數約為0.164。隨著熱處理溫度的增加，乳液的澄清指數也顯著降低。當熱處理溫度增加到85 ℃時，乳液在離心測定結束后，其穩定性輪廓圖幾乎與初始輪廓圖保持一致，尤其是SPI熱處理溫度為95 ℃時制備的乳液，在經過140 min的離心測試后，輪廓線未發生任何變化，其澄清指數降低到0.001。此結果與圖1所示的結果一致，熱處理顯著提高了SPI穩定乳液的EAI和ESI，由此其穩定性也相應地增加。

a-Native-SPI輪廓圖；b-60 ℃-SPI輪廓圖；c-85 ℃-SPI輪廓圖；d-95 ℃-SPI輪廓圖；e-澄清指數圖2 熱處理溫度對SPI乳液穩定性的影響Fig.2 Effect of heat treatment temperature on the stability of SPI emulsion

2.2 不同溫度熱處理SPI對蛋白乳液凝膠性質的影響

如圖3-a所示，65 ℃及85 ℃熱處理的SPI乳液凝膠顯示出與Native乳液凝膠相近的凝膠性能，三者的硬度無顯著差異(P>0.05)，這與SPI的熱變性程度密切相關，SPI主要由大豆球蛋白(11S)和β-伴球蛋白(7S)組成。郭鳳仙等[20]研究發現7S組分的變性溫度為74.2 ℃，而11S組分的變性溫度則為90 ℃，在65 ℃處理條件下，此時僅有7S組分發生部分變性，因此凝膠性與Native樣品相近。先前的研究表明，隨著大豆蛋白熱處理溫度的增加，形成的熱聚集體粒徑也相應增加，但當大豆蛋白接近完全變性后，平均粒徑反而由于高溫熱處理導致大粒徑聚集體熱解聚，從而使得粒徑呈現降低的趨勢[21-23]。因此，當溫度升高到85 ℃時，凝膠性沒有顯著增加的原因可能是由于在以TGase誘導SPI交聯形成凝膠時，隨著溫度的升高，蛋白分子發生疏水性聚集，從而導致TGase反應位點減少。然而，當熱處理溫度升高至95 ℃時，7S、11S組分均完全變性，高溫將導致SPI分子發生熱解聚，蛋白分子重排和聚集，從而使得更多的TGase反應位點被暴露，凝膠強度顯著增強，其制備的乳液凝膠硬度是Native乳液凝膠的2.2倍。如圖3-b所示，盡管不同樣品間硬度存在很大差異，但凝膠的持水性和持油性均沒有顯著差異(P>0.05)，都表現出良好的穩定性。

通過圖3-c和圖3-d可以看出，隨著SPI熱處理溫度的升高，乳液凝膠的氣孔也相應增加，且氣孔尺寸也呈現增大的狀態，這種現象是由于乳液黏度的增加所導致的。由不同熱處理溫度的SPI穩定的乳液的表觀黏度如圖3-e所示。所有的SPI乳液均呈現剪切變稀的特性，表現出典型的假塑性流體特征。65 ℃熱處理的蛋白乳液表現出與Native蛋白乳液相近的黏度，而隨著熱處理溫度進一步增加，乳液的黏度也逐漸增加。前期的研究中發現，隨著熱變性溫度的升高，SPI的疏水性也顯著增加[17-18]。因此黏度顯著增加的原因可能是由于蛋白分子間具有更高的聚集度和疏水性，從而增加乳液體系中SPI分子之間的相互作用，進而導致乳液呈現更高的表觀黏度。蛋白的表觀黏度隨著疏水性的增加而增加的趨勢也與ZHENG等[24]的研究結果一致。

由于95 ℃-SPI制備的乳液凝膠具有最高的凝膠性，因此后續以其為對象進一步研究蛋白濃度、油濃度對TGase交聯的乳液凝膠的影響。

a-凝膠硬度；b-持水/油性；c-宏觀凝膠形態；d-微觀凝膠形態；e-表觀黏度圖3 熱處理溫度對SPI乳液凝膠硬度、持水/油性、宏觀、微觀凝膠形態及表觀黏度的影響Fig.3 Effect of heat treatment temperature on gel hardness, water/oil holding capacity, macrograph, micrographof SPI emulsion gel, and apparent viscosity of SPI emulsion

2.3 不同蛋白濃度對SPI乳液凝膠性質的影響

圖4-a為蛋白濃度對SPI乳液凝膠硬度的影響，蛋白濃度對蛋白質凝膠性能至關重要，凝膠網絡的形成是蛋白分子間作用、分子和溶劑相互作用以及鄰近肽鏈之間的相互吸引和相互排斥平衡后的結果[25]。當蛋白濃度為8%時，乳液凝膠的硬度僅為861.4 g。這是由于當蛋白濃度較低時，SPI分子-溶劑之間作用處于優勢地位，致使蛋白乳液形成的凝膠網絡弱。隨著SPI濃度的增加，乳液凝膠的硬度呈現顯著增加的趨勢(P<0.05)。當蛋白濃度升高至12%時，此時的凝膠硬度是蛋白濃度為8%樣品的3.3倍，此時蛋白分子間的相互作用占據優勢地位，蛋白與蛋白分子之間的相互作用也顯著增強，凝膠強度也相應的增加。通過圖4-b和圖4-c可以觀察到，蛋白濃度從8%增加到12%，均能制備出硬挺、均勻的乳液凝膠。但隨著濃度的增大，凝膠形成的氣孔也由小變大。從圖4-d可以看出在不同蛋白濃度下(8%～12%)，SPI乳液凝膠均具有優異的持水性和持油性，說明凝膠具有緊密的網絡結構。

a-凝膠硬度；b-宏觀形態；c-微觀形態；d-持水/油性圖4 SPI濃度對蛋白乳液凝膠硬度、宏觀形態、微觀形態和持水/油性的影響Fig.4 Effect of SPI concentration on the gel hardness, macrograph, micrograph, and water/oil holding capacity of SPI emulsion gel

2.4 不同油濃度對SPI乳液凝膠性質的影響

圖5-a探究了不同油濃度對乳液凝膠硬度的影響，隨著油濃度從5%增加到20%，乳液凝膠的硬度顯著增大(P<0.05)。這是由于隨著油濃度的增加，蛋白在乳液水相的濃度也相應增加，因此，SPI蛋白分子分布更緊密，蛋白質分子間的相互作用增強，從而導致SPI乳液凝膠的凝膠性能改善。通過圖5-b和圖5-c可以觀察到，油濃度從5%增加到20%所制備的SPI乳液凝膠均具有優異的形態，形狀規整，不軟塌。但隨著油濃度的增加，凝膠形成的氣孔也由少變多，由小變大。從圖5-d可以看出，在不同油濃度下(5%～20%)，SPI乳液凝膠均具有優異的持水性和持油性，說明95 ℃-SPI穩定的乳液凝膠具有優異的凝膠網絡，可束縛住乳液凝膠體系中的水相和油相。

a-凝膠強度；b-宏觀形態；c-微觀形態；d-持水/油性圖5 油濃度對蛋白凝膠強度、宏觀形態、微觀形態和持水/油性的影響Fig.5 Effect of oil concentration on the gel hardness, macrograph, micrograph, and water/oil holding capacity of SPI emulsion gel

3 結論

SPI經熱處理后，其EAI、ESI和乳液離心穩定性均有顯著改善。不同熱處理溫度的SPI樣品經TGase誘導形成凝膠后，凝膠強度在95 ℃時得到顯著改善，其凝膠硬度是天然蛋白乳液凝膠的2.2倍。表明大豆蛋白分子經過一定程度的熱處理，逐漸形成聚集體，對TGase誘導乳液凝膠形成有促進作用。且隨著溫度的增加，乳液黏度相應增加，凝膠氣孔也相應增大。對于95 ℃熱處理蛋白的凝膠，隨著蛋白濃度的增大，凝膠強度增大；隨著油濃度的增加，凝膠強度顯著增加。所有樣品均具有優異的持水性和持油性?？傊琒PI經過一定程度的熱處理(95 ℃)有利于TGase誘導形成蛋白凝膠，這為工業生產蛋白基乳液凝膠制品提供了一定的理論依據。