液相色譜-串聯質譜法測定畜禽肉和雞蛋中氨基酸含量

李智，周燦，費華熙，王素利，鄭連姬*

1(重慶食品工業研究所有限公司，重慶，400042)2(中國輕工業聯合會食品質量監督檢測重慶站，重慶，400042)

氨基酸是蛋白質和酶的基本組成部分。氨基酸可按照氨基連在碳鏈上的不同位置而分為α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、ω-氨基酸。平常我們所知的經蛋白質水解后得到的氨基酸均為α-氨基酸，機體內常見氨基酸有20種，其中有8種氨基酸高等動物無法自主合成，包括賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸(又名甲硫氨酸)、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸，這些氨基酸必須通過不斷攝取食物來獲取。

氨基酸在體內重要的生理功能不僅是參與合成蛋白質和其他含氮化合物，還作為信號分子參與機體多種生理進程的調控，越來越多的學者證明氨基酸可作為信號分子參與細胞內信號傳導過程，可以調控機體能量和糖脂代謝，最終導致機體整體代謝的改變[1]。如在厭氧狀態下機體啟動糖原分解時，谷氨酸和天冬氨酸對線粒體的氧化磷酸化和ATP合成進行調節[2]；亮氨酸可以通過激活谷氨酸脫氫酶從而促進胰島β細胞合成胰島素[3]。

由于氨基酸分析在蛋白質化學、生物化學、食品科學、臨床醫學等領域的研究中起著重要的作用，因此，對氨基酸分析方法的研究與改進引起人們高度重視。目前報道的氨基酸檢測方法有紫外分光光度法[4]、熒光光度法[5]、紅外光譜法[6]、高效陽離子交換色譜法[7-8]、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法[9]、高效液相色譜法[10]、毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)[11]、氣相色譜法[12]、氣相色譜-質譜聯用法[13]等。這些方法通常采用鄰苯二甲醛[14]、異硫氰酸苯酯[15]、9-氯甲酸芴甲酯[16]、丹磺酰氯[17]、二硝基氟苯、1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺[18]、磺酰氯二甲胺偶氮苯[19]、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯[20]、2,4-二硝基氯苯[21]等衍生試劑進行衍生，這使得試劑消耗量大、檢測步驟復雜、檢測周期長。應用液相色譜串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)檢測氨基酸可以直接分析提取物中的氨基酸，無需采用衍生步驟[22-25]。本文通過對樣品水解條件、質譜、色譜條件的優化，在電噴霧離子源(electron spray ionization, ESI)正離子掃描模式下檢測，建立了液相色譜-串聯質譜測定動物源性食品畜禽肉和雞蛋中氨基酸的檢測方法，并將檢測結果與我國國家標準自動氨基酸測定方法進行了比較，以期建立一種適用于畜禽肉和雞蛋中氨基酸檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基酸標準溶液(包括半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸)，上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇為色譜純，河北百靈威超精細材料有限公司；鹽酸、苯酚、甲酸、乙酸銨、檸檬酸鈉等均為國產分析純，重慶川東化工(集團)有限公司。豬肉、雞蛋、雞肉，市售。

1.2 儀器與設備

Agilent 6460 Triple Quad LC-MS/MS儀，美國安捷倫公司；TOPEX+微波消解儀，上海屹堯儀器科技發展有限公司；BGZ-240電熱鼓風恒溫箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；RE-52A真空旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；ZFK-040電熱真空干燥箱，上海實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品水解

1.3.1.1 酸水解

稱取均勻試樣2 g于水解管中，加入15 mL 6 mol/L HCl溶液，加入3～4滴苯酚，將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min，接到真空泵的抽氣管上，抽真空(接近0 Pa)，然后充入N2，重復抽真空-充入N23次后，在充N2狀態下封口或擰緊螺絲蓋。將已封口的水解管放在(110±1) ℃的電熱鼓風恒溫箱內，水解22 h后，取出，冷卻至室溫。打開水解管，將水解液過濾至50 mL容量瓶內，用少量水多次沖洗水解管，水洗液移入同一容量瓶(50 mL)內，最后用水定容至刻度，振蕩混勻。準確吸取1.0 mL濾液移入到15 mL或25 mL試管內，用真空旋轉蒸發儀在40～50 ℃加熱環境下減壓干燥，干燥后殘留物用1～2 mL水溶解，再減壓干燥，最后蒸干。用1.0～2.0 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖溶液加入到干燥后試管內溶解，振蕩混勻后，吸取溶液通過0.22 μm濾膜后，備用。

1.3.1.2 高壓水解

稱取均勻試樣0.5 g，置于50 mL消解管內，加入15 mL HCl溶液，加入2滴苯酚，于110 ℃鼓風干燥箱中消解6 h，取出冷卻，將水解液全部轉移至 50 mL容量瓶中，用一級水定容至刻度，搖勻、過濾，精密吸取1 mL于40～50 ℃加熱環境下減壓干燥，殘留物用0.1%(體積分數，下同)甲酸溶液定容至刻度，搖勻，經0.22 μm的微孔濾膜過濾，備用。

1.3.1.3 微波水解

稱取均勻試樣0.5 g，置于100 mL消解管內，加入15 mL HCl溶液，加入2滴苯酚，于80 ℃消解爐內消解30 min，取出冷卻，轉移至微波消解儀上150 ℃，消解4 h，取出冷卻，將水解液全部轉移至50 mL容量瓶中，用一級水定容至刻度，搖勻、過濾，精密吸取1 mL于10 mL容量瓶中，置于真空干燥箱內，于50 ℃減壓干燥(真空干燥箱內放入P2O5作為干燥劑)，干燥后殘留物用0.1%甲酸溶液定容至刻度，搖勻，經0.22 μm的微孔濾膜過濾，備用。

1.3.2 色譜條件

1.3.2.1 液相色譜條件

色譜柱：AthehaC8-WP(2.1 mm×150 mm，3 μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液+10 mmol/L乙酸銨，流動相B為甲醇；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；柱溫25 ℃；梯度洗脫參數見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.2.2 質譜條件

離子源：ESI源；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)；電噴霧電壓：3 500 V；離子源溫度：300 ℃；氣流：5 L/min；霧化器壓力：45 psi；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流：11 L/min；噴嘴電壓：500 V。

1.3.3 方法學驗證

檢出限、精密度、回收率的測定。

1.4 數據統計與分析

每個實驗重復3次，采用SPSS 19.0統計分析軟件進行統計處理。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

分別取5 μL質量濃度為1 μg/L氨基酸單標溶液，先后進行母離子和子離子掃描，獲得穩定性好、信號強度高的碎片離子，通過MRM模式Fragmenton優化不同氨基酸的錐電壓和CE電壓。結果見表2。

表2 十七種氨基酸質譜參數Table 2 MS parameters for the 17 amino acids

2.2 色譜條件優化

在優化的質譜條件下，考察不同色譜柱和不同流動相對目標物質譜信號的影響。對比了3種色譜柱，ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm，1.8 μm)，ZORBAX SB-C18(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)，AthehaC8-WP(2.1 mm×150 mm，3 μm)。分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液(10 mmol/L乙酸銨)、乙腈- 0.1%甲酸水溶液(10 mmol/L 乙酸銨)幾種流動相對目標化合物的影響。結果顯示，使用AthehaC8-WP(2.1 mm×150 mm，3 μm)色譜柱和甲醇-0.1%甲酸水溶液(10 mmol/L乙酸銨)體系，效果更好。甲醇較乙腈在離子響應及分離度上更好，而加入了甲酸可以明顯提高17中氨基酸的離子化效率，乙酸銨能提高信號響應并能有效解決峰拖尾問題。在梯度洗脫條件下目標物出峰較均勻，峰形較好，分離度好，保留時間適中。17種氨基酸的總離子流圖見圖1。

1-Lys;2-His;3-Arg;4-Gly;5-Cys;6-Ser;7-Ala;8-Asp;9-Thr;10-Glu;11-Pro;12-Val;13-Met;14-LLE;15-Leu;16-Tyr;17-Phe圖1 十七種氨基酸的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 17 amino acids

2.3 基質效應的研究

值得注意的是，動物源性食品在LC-MS/MS的分析方法中存在明顯的基質效應，但是不含氨基酸的空白基質難以獲取，無法采用配制基質匹配工作曲線的方法消除基質效應。另外氨基酸內標溶液價格異常昂貴，不利于成本控制。因此本實驗增大樣品提取液的稀釋倍數以削弱甚至消除基質效應。實驗過程中考察了將1.3.1中備用液稀釋1、5、40、50倍(相當于稱樣后稀釋500、2 500、20 000、25 000倍)時氨基酸的含量，實驗結果見圖2。隨著稀釋倍數的增大，各氨基酸的測定值也逐漸增大，稀釋至20 000～25 000倍時，氨基酸含量基本不變，即稀釋倍數500、2 500和20 000、25 000之間有顯著性差異，稀釋倍數為20 000和25 000之間無顯著性差異。這說明各氨基酸在動物源性食品基質中呈現基質減弱效應，隨著稀釋倍數的增大，樣液中基質含量相應減小，基質減弱效應也逐漸衰弱，稀釋至20 000倍及以上時，樣液中極微量的基質對氨基酸的影響基本可以忽略不計。因此在后續實驗中將1.3.1中備用液稀釋40倍(相當于稱樣后總稀釋倍數為20 000倍)，經0.22 μm的微孔濾膜過濾后上機測定。

圖2 稀釋倍數對基質效應的影響Fig.2 Effect of dilution ratios on matrix effect注：n=3，不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.4 樣品水解條件優化

2.4.1 微波水解條件的優化

2.4.1.1 微波溫度的優化

固定微波水解時間6 h，通過改變水解溫度(130、140、150、160、170、180 ℃)考察氨基酸含量變化。結果表明，隨著溫度的升高，水解得到的氨基酸含量逐漸增大，150 ℃時氨基酸含量最大，高于150 ℃時部分氨基酸含量有所下降，因此選擇150 ℃為最佳水解溫度。

2.4.1.2 微波時間的優化

固定微波水解溫度150 ℃，通過改變水解時間(2、3、4、5、6 h)考察氨基酸含量變化。結果表明，隨著水解時間的增加，水解得到的氨基酸含量逐漸增大，4 h時氨基酸含量最大，時間>4 h時部分氨基酸含量略有下降，可能是因為個別氨基酸被破壞。因此選擇4 h為最佳水解時間。

2.4.2 樣品水解方法的確定

酸水解法蛋白質水解徹底，水解過程中不發生消旋化。缺點是該水解方法耗時長，步驟繁瑣，容易對實驗測定帶來誤差。酸水解法也是目前我國氨基酸檢測國家標準中普遍采用的水解方法。高壓水解法是以酸水解為基礎，解決了酸水解方法耗時長、步驟繁瑣的問題，一般6 h可以完成。微波水解法利用微波輻射引起物體內部分子相互摩擦而產生熱能，促使分子發生極化旋轉。該方法水解快，一般4 h可以完成。

為了解決傳統的酸水解法耗時長、步驟繁瑣的問題，本實驗以酸水解法為對照，微波水解法和高壓水解法進行了比較，比較結果見表3。微波水解法與傳統的酸水解法氨基酸測定結果之間無顯著性差異，高壓水解法測定結果中有個別氨基酸(精氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、纈氨酸、脯氨酸)的測定結果與傳統的酸水解，微波水解法有顯著性差異，大部分氨基酸無顯著性差異。說明，微波水解法可以把水解時間從傳統酸水解24 h縮短為4 h，并且檢測步驟簡單，易操作。

表3 三種不同水解方法比較結果Table 3 Three different hydrolysis methods comparison results

2.4.3 樣品稱樣量的確定

為了確定不同的稱樣量對微波水解效果的影響，本實驗分別稱取豬肉0.1、0.2、0.5、0.6、1.0 g進行微波消解后測定17種氨基酸含量，結果見圖3。稱樣量為0.5 g時水解效果最優，因此采用稱樣量為0.5 g。

圖3 稱樣量對水解效果的影響Fig.3 Influence of sample weight on the hydrolysis effect

2.5 檢出限

配制混合標準溶液質量濃度為5.0～375.0 ng/mL的標準溶液，測定峰面積，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準溶液的工作曲線，在此質量濃度范圍內，標準品質量濃度與峰面積值均有良好的線性關系，檢出限(limit of detection，LOD)以1/3信噪比評估法計算得出。具體線性方程及相關系數，檢出限見表4。

表4 十七種氨基酸的線性方程、相關系數(R)和檢出限Table 4 The linear equation, correlation coefficient (R) and detection limit of 17 amino acids

2.6 準確度及精密度

采用添加回收的方法，測定不同動物源性食品基質中回收率，按表5中添加高、中、低水平做7次平行樣品，測定精密度，結果見表5。不同動物源性食品基質中各氨基酸的回收率為85%～96%，精密度(relative standard deviation，RSD)為0.01%～0.71%。

續表5

2.7 LC-MS/MS與傳統氨基酸分析儀方法比較

為了進一步驗證LC-MS/MS測定動物源性食品畜禽肉和雞蛋中氨基酸含量方法的可行性，與傳統的氨基酸分析儀方法進行了比較，結果見表6。不同的動物源性樣品采用氨基酸分析儀和LC-MS/MS測定結果無顯著性差異，說明微波水解-LC-MS/MS法可以用于動物源性食品畜禽肉和雞蛋中氨基酸含量的測定。

3 結論

本文采用微波消解技術消解畜禽肉和雞蛋中蛋白質為游離氨基酸，以0.1%甲酸水溶液+10 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇為流動相，梯度洗脫，串聯質譜正離子模式進行監測，外標法定量，測定動物源性食品畜禽肉和雞蛋中17種氨基酸。數據表明，本方法耗時短、操作較為簡便、快捷、精密度高，樣品分離度好，測定結果準確可靠，靈敏度高，所用試劑成本低，能滿足動物源性食品畜禽肉和雞蛋中17種氨基酸的檢測。