mNGS技術和血清G試驗在判斷耶氏肺孢子菌感染與定植中的價值及二者相關性研究

張彩霞，劉新年，杜川，王新衛

耶氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia，PJP）是由耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii，PJ）引起的人類呼吸系統機會性感染，多發生于免疫功能低下者。由于PJ不能在體外培養基生長，故目前確診PJP仍是通過染色鏡檢發現呼吸道標本特征性的包囊或滋養體為主，但傳統的染色方法靈敏度不高，使得大部分PJP患者不能得以準確、快速確診[1]。因此，還需結合臨床表現以及其他檢測方法。目前，多項研究顯示血清1，3-β-D葡聚糖定量檢測（G試驗）[2-6]可輔助診斷PJP，且數值的高低可鑒別PJ定植和感染，數值越高，感染可能性越大，但鑒別二者的截斷值尚無定論。另外，隨著宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）技術興起，由于該技術具有廣覆蓋、迅速高敏、無偏倚性的特點，已被廣泛應用于疑難、危重、特殊病原體檢測[7-9]及感染性疾病診斷中[10-12]，因此提高了PJP的診斷率。盡管mNGS應用前景廣闊，但仍存在無法明確背景菌、污染菌、定植菌、致病菌等情況，尤其PJ可以共生或以正常菌群的形式定植于人體呼吸道，故當mNGS檢出PJ序列時，那么其是定植還是感染呢？其有無合適的截斷值予以判斷呢？本研究擬通過比較PJ感染者與定植者的臨床特點以及血清G試驗、肺泡灌洗液mNGS序列數的差異，從而探討肺泡灌洗液mNGS技術、血清G試驗在判斷PJ感染與定植中的價值以及二者相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對2018年9月至2022年5月在江漢大學附屬湖北省第三人民醫院收治住院治療且行肺泡灌洗液mNGS技術檢出PJ序列數的40例肺部感染患者的病例資料進行回顧性分析。根據mNGS檢出PJ是否抗PJ治療分為兩組：PJ感染組（mNGS檢出PJ，抗PJ治療有效者）21例，PJ定植組（mNGS檢出PJ，未抗PJ治療好轉出院者）19例。PJP診斷標準：（1）臨床表現為咳嗽、發熱、呼吸困難、進行性缺氧等；（2）影像學表現為多發性結節、多發斑片影或實變影、磨玻璃樣改變或肺間質彌漫浸潤病變等；（3）mNGS檢出PJ序列；（4）由兩位及以上具有高級職稱且經驗豐富的醫生共同診斷；（5）抗PJ治療有效。兩組排除標準：（1）年齡<18歲；（2）無肺部感染及病原學證據；（3）mNGS前行經驗性抗PJ治療者；（4）肺部真菌感染者，嚴重心臟疾病及嚴重心律失常者，近1個月發生心腦血管事件者，嚴重精神心理性疾病及無行為能力不能配合完成肺泡灌洗液mNGS檢查者等；（5）臨床資料不完整；（6）后期隨訪不符合診斷者。本研究通過江漢大學附屬湖北省第三人民醫院倫理委員會審批（2022倫審科第009號）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 收集患者一般資料包括性別、年齡、體質指數（BMI）、吸煙史（定義：近1年內平均至少吸煙1支/d）、基礎疾病及用藥史〔慢性腎臟疾病、血液系統疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、實體器官移植、慢性肺部疾病、糖皮質激素/免疫抑制劑使用情況〕，臨床癥狀（發熱、咳嗽、咳痰、呼吸困難、胸痛、咯血），影像學特點（磨玻璃滲出影、間質改變、實變、結節、胸腔積液、囊狀），實驗室指標〔白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、降鈣素原（PCT）、C反應蛋白（CRP）、乳酸脫氫酶（LDH），動脈血氧分壓/吸入氧濃度百分比（PaO2/FiO2）、CD4+T淋巴細胞計數〕，進行血清G試驗、半乳甘露聚糖檢測（GM試驗，用于鑒別真菌感染患者）。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液采集 患者禁水、禁食4 h，2%利多卡因噴霧局部麻醉咽部和鼻腔后，在olympusBF-260型電子支氣管鏡下采集支氣管肺泡灌洗液，按《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識（2017年版）》[13]進行操作，嚴格遵守無菌原則，灌洗部位根據胸部影像學確定，病變局限者選擇病變段，彌漫性病變者選擇右肺中葉或左肺上葉舌段。當支氣管鏡到達目標支氣管段或亞段后，將頂端嵌頓在入口處，經操作孔道快速注入37℃ 0.9%氯化鈉溶液，總量60～120 ml，分次注入（20～50 m1/次），注入后立即以100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）負壓抽吸，回收率40%～60%，回收的灌洗液裝入滅菌容器中，一份（≥10 ml）送檢進行常規細菌、真菌培養，一份（≥5 ml）行mNGS檢測。

1.2.3 mNGS檢測方法 支氣管肺泡灌洗液干冰保存送至深圳華大基因（mNGS標本的采集、保存和運輸嚴格按照該公司標準化規范執行）行mNGS檢測，對樣本中微生物核酸序列進行分析，與該公司病原數據庫進行比對，得出報告結果序列數，從而對微生物進行鑒定。檢測過程包括：核酸提取、RNA逆轉錄、目標片段化、文庫構建、上機測序（測序下機后去除低質量和長度<35 bp的數據以獲得高質量的數據）、生物信息分析、報告解讀等。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，采用Mann-whitney U檢驗進行組間比較；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗、校正χ2檢驗或Fisher's確切概率法；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線評估mNGS與血清G試驗判斷PJ感染與定植的價值，計算ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）、靈敏度、特異度、最佳截斷值。采用Spearman秩相關分析mNGS與血清G試驗相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料、基礎疾病及用藥史比較 兩組性別、年齡、BMI、吸煙史、基礎疾病情況比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；PJ感染組糖皮質激素/免疫抑制劑使用率較PJ定植組高，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 兩組患者一般資料、基礎疾病及用藥史比較Table 1 Comparison of general information，underlying diseases and medication history between two groups

2.2 臨床癥狀及影像學特點比較 PJ感染組與PJ定植組發熱、咳嗽、咳痰、呼吸困難、胸痛、咯血比例比較，差異無統計學意義（P>0.05）。PJ感染組磨玻璃滲出影、間質改變比例高于PJ定植組，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組實變、結節、胸腔積液、囊狀比例比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 兩組患者臨床癥狀及影像學特點比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of clinical symptoms and imaging characteristics between two groups

2.3 實驗室指標比較 兩組白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、PCT、CRP、LDH、PaO2/FiO2比較，差異無統計學意義（P>0.05）；PJ感染組CD4+T淋巴細胞計數低于PJ定植組，血清G試驗、mNGS序列數高于PJ定植組，差異均有統計學意義（P<0.05，表3）。

表3 兩組患者實驗室指標比較Table 3 Comparison of laboratory indicators between two groups

2.4 mNGS序列數與血清G試驗鑒別PJ感染與定植的價值 mNGS序列數與血清G試驗鑒別PJ感染與定植的最佳截斷值分別為24個、106.7 ng/L，AUC分別為0.95、0.89，靈敏度分別為95.2%、76.2%，特異度分別為78.9%、89.5%（圖1、表4）。

表4 mNGS序列數與血清G試驗鑒別PJ感染與定植的價值Table 4 Value of the number of sequences of pneumocystis jirovecii detected by mNGS and serum G level measured by serum G test in differentiating pneumocystis jirovecii infection from colonization

圖1 mNGS序列數與血清G試驗鑒別感染與定植ROC曲線Figure 1 The ROC curve of the number of sequences of pneumocystis jirovecii detected by mNGS and serum G level measured by serum G test in differentiating pneumocystis jirovecii infection from colonization

2.5 血清G試驗與mNGS序列數相關性分析Spearman秩相關結果示mNGS檢出PJ序列數與血清G試驗水平呈正相關（rs=0.769，P<0.001，圖2）。

圖2 mNGS檢出PJ序列數與血清G試驗的相關性Figure 2 Correlation between the number of pneumocystis jirovecii sequences detected by mNGS and serum G level measured by serum G test

3 討論

由于呼吸道PJ定植相當普遍[14-15]，為避免臨床過度治療及延誤治療，識別定植與感染很重要。本回顧性研究通過比較PJ感染與定植不同之處，以期能為臨床鑒定感染與定植提供依據。

在一般資料、基礎疾病、用藥史方面，本研究發現19例PJ定植組和21例PJ感染組絕大多數來自免疫缺陷患者如HIV感染、血液系統疾病、惡性腫瘤、實體器官移植、自身免疫性疾病、長期使用糖皮質激素/免疫抑制劑者等，部分來自慢性肺部疾病，另外定植組尚可見于免疫功能正常人群。因此，PJ感染或定植除需重點關注免疫抑制個體人群外，尚需關注慢性肺部疾病。BABIC-ERCEG 等[16]及LOWE等[17]的研究亦提示PJ感染或定植與慢性阻塞性肺疾病、肺囊性纖維化以及間質性肺炎等多種呼吸系統疾病密切相關。可見，慢性肺部疾病在PJ感染或定植中亦扮演一定角色。同時，本研究發現PJ感染組約52.4%患者接受過糖皮質激素/免疫抑制劑治療，而PJ定植組19例中僅有1例使用過糖皮質激素/免疫抑制劑，提示長期應用此類藥物可能是PJ感染的高危因素。因此，當存在上述基礎疾病，尤其接受糖皮質激素/免疫抑制劑治療的患者應該警惕PJP的發生。

在臨床表現方面，本研究發現PJ感染組與定植組在臨床癥狀如發熱、咳嗽、咳痰、呼吸困難、胸痛、咯血等癥狀間并無明顯差異，提示通過臨床癥狀無法區分二者。近年來，臨床上常用肺部影像學改變、血液中CD4+T淋巴細胞計數、血清G試驗、LDH等[18-19]指標輔助診斷或預測PJP。本研究發現PJ感染組典型磨玻璃滲出影、間質改變高于PJ定植組，但兩組影像學特點如實變、結節、胸腔積液、囊狀改變間比較無統計學差異。同時，本研究中兩組LDH并無差異性，與ESTEVES等[2]研究一致，提示靠LDH無法鑒別定植與感染，分析原因可能為LDH升高更多反映的是肺組織損傷的嚴重程度，不具特異性。但血清G試驗PJ感染組明顯高于定植組，與LIU等[20]研究一致，分析原因可能與當PJ感染后經肺泡巨噬細胞吞噬、消化，1，3-β-D葡聚糖從胞壁中釋放入血有關。另本研究發現PJ感染組CD4+T淋巴細胞計數明顯低于定植組，幾乎所有PJP患者的外周血CD4+T淋巴細胞計數<200個/μl，而且發現此部分患者mNGS檢出PJ序列數明顯高于定植組。因此，對于某些免疫功能低下的患者，在治療過程中需密切監測CD4+T淋巴細胞計數，一旦CD4+T淋巴細胞數呈下降趨勢時，需警惕PJ感染，此時可結合影像學、血清G試驗、mNGS檢查來判斷。

鑒于多項研究[4-6]顯示血清G試驗對于診斷PJP以及判斷治療效果有一定的價值。而DAMIANI等[21]人發現，實時熒光定量PCR可以根據PJ序列數不同來區分PJ感染或定植，但是序列數的臨界值很難確定。基于此，是否可以根據mNGS檢出PJ序列數及血清G試驗來區分PJ感染和定植呢，其鑒別二者的臨界值又如何呢。本研究以臨床最終診斷PJP感染與定植為“金標準”，發現mNGS序列數與血清G試驗鑒別感染與定植的最佳截斷值分別為24個、106.7 ng/L，AUC分別為0.95、0.89，靈敏度分別為95.2%、76.2%，特異度分別為78.9%、89.5%。同時，本研究分析了血清G試驗與mNGS檢出PJ序列數相關性，以期了解血清G試驗與PJ負荷是否相關。本研究發現mNGS檢出PJ序列數與血清G試驗水平呈正相關，與JIANG等[22]研究一致，但與HELD等[23]和LIU等[20]的研究不同，他們認為血清G試驗與PJ負荷并不相關。分析造成差異的原因可能為：1，3-β-D葡聚糖并非PJ特異性標志物，且各研究間納入分組標準及樣本量不同。因此，本研究提示血清G試驗與mNGS除可以輔助診斷PJP外，尚可將PJ感染與定植區分，當血清G試驗水平≥106.7 ng/L、mNGS檢出PJ序列數≥24個時，診斷PJ感染價值較大，mNGS檢出PJ序列數與血清G試驗水平呈正相關。

PJ定植相當普遍，臨床上如何鑒別定植與感染是一大難題，本研究通過比較PJ感染者與定植者間臨床特點、血清G試驗、肺泡灌洗液mNGS序列數的差異，從而探索血清G試驗及肺泡灌洗液mNGS序列數判斷PJ感染與定植的價值，并求得截斷值，為臨床判斷定植與感染提供了幫助，避免過度治療及延誤治療。但本研究亦存在一定局限性：（1）mNGS報告的解讀，尚無統一標準，盡管本研究嘗試了判斷PJ感染與定植的mNGS序列數截斷值，但由于受樣本量小的局限，未動態監測血清G試驗與mNGS中PJ序列數變化以了解其對評估治療療效有無價值。今后需擴大樣本量，進行多中心前瞻性研究進一步驗證。（2）對于判斷PJ感染與定植，無標準的診斷參數，本研究以是否抗PJ治療有效且經隨訪確認，故可能存在一定選擇偏倚。

綜上，考慮鑒別PJ感染與定植的模型可能包含：（1）免疫缺陷，尤其糖皮質激素/免疫抑制劑使用；（2）影像學表現為典型磨玻璃滲出影、間質改變；（3）外周血CD4+T淋巴細胞計數降低，尤其<200個/μl；（4）血清G試驗升高；（5）mNGS檢出PJ序列數。血清G試驗及mNGS檢出PJ序列數數值越高，感染可能性越大，血清G試驗與PJ負荷呈正相關。今后研究方向：擴大樣本量，動態監測血清G試驗與mNGS中PJ序列數變化，了解其對評估治療療效有無價值。

作者貢獻：張彩霞進行文章的構思與設計，文章的可行性分析，文獻及資料收集、整理，撰寫論文；劉新年進行論文的修訂；杜川協助采集數據、分析數據；王新衛負責文章的質量控制及審校，技術支持，對文章整體負責。

本文無利益沖突。